Papel da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) em Trypanosoma cruzi - Gregório, Nathaly Renata Henrique [UNIFESP] (2021)
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, causador da doença de Chagas. Durante o seu ciclo biológico o T. cruzi apresenta uma alta capacidade de adaptação ambiental, pois vive em diferentes hospedeiros em cada etapa do seu ciclo de vida. Entretanto os mecanismos que medeiam estas adaptações ainda não são bem conhecidos e se postula que dependem da disponibilidade de nutrientes e da presença de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Um dos principais mecanismos envolvidos no controle do estado energético de células eucariotas ocorre por meio da proteína quinase ativada pelo aumento de AMP (AMPK), que fosforila diferentes substratos modificando o metabolismo para produzir energia em estados de carência nutricional. A AMPK é um heterotrímero formado por duas subunidades reguladoras (β e γ) e uma subunidade catalítica (α). Já foi mostrado que a ativação da AMPK de Trypanosoma brucei é capaz de induzir a diferenciação da forma replicativa à forma quiescente e que esta ativação está relacionada à indução de autofagia. Genes que codificam proteínas homólogas a AMPK estão presentes em T. cruzi, mas o seu papel ainda não é conhecido neste parasita. Neste trabalho investigamos o papel da TcAMPK em T. cruzi enquanto proteína sinalizadora como já descrito em outros eucariotos. Ensaios in silico mostraram conservação estrutural e de composição de aminoácidos das subunidades da TcAMPK com outros organismos. A alça catalítica das subunidades α1 e α2 são conservadas, porém a TcAMPKα1 exibe uma treonina na posição correspondente a serina 172, aminoácido fosforilável responsável pela ativação da proteína em eucariotos superiores. Utilizando um anticorpo específico para estas fosforilações verificamos que a enzima nas formas epimastigotas se fosforila gradativamente nas primeiras 24 horas quando os parasitas são inoculados em meio rico onde a concentração de ATP intracelular não variou. A fosforilação também foi detectada na subunidade α1 em fusão com mNeonGreen confirmando se tratar da AMPK. A fosforilação mostrou ser dependente da presença de espécies reativas de oxigênio e independente da presença de glicose no meio. Em meio privado de todos os nutrientes, ocorreu fosforilação simultaneamente ao decréscimo de ATP. Neste caso a fosforilação foi inibida pelo Composto C (Dosomorfina), potente inibidor da AMPK de diversos organismos. Em meio pobre a dosomorfina causou perda de viabilidade e os parasitas sofreram uma mudança morfológica, exibindo um formato esférico e sem flagelo similar à forma amastigota. A adição de nutrientes como glicose, prolina e ácido glutâmico diminuíram o decréscimo de ATP mesmo na presença do Composto C favorecendo a sobrevivência dos epimastigotas e não afetaram a fosforilação da AMPK. Várias tentativas de se obter parasitas depletados tanto na subunidade α1 como α2 foram infrutíferas sugerindo que a atividade da AMPK seja essencial para o crescimento do parasita. Assim, concluímos que a AMPK em T. cruzi é ativada continuamente e essa fosforilação é modulada pelos níveis de ATP e em diferentes condições de crescimento.