Padronização da técnica de espectrometria de massa por dessorção e ionização a laser - assistida por matriz para a detecção das proteínas de membrana externa em Klebsiella pneumoniae - Silva, Ana Carolina Ramos da [UNIFESP] (2015)
Objetivo: A presente dissertação de mestrado teve como objetivo padronizar a detecção da porina OmpK36 em isolados de K. pneumoniae pela metodologia de espectrometria de massa por MALDI-TOF. Métodos: A reprodutibilidade e padronização da técnica foi avaliada por três extratos proteicos do controle 192 que expressa a OmpK36 e dos isolados clínicos 7726 e 7461 com seus respetivos DLs 7726-1 e 7461-4 pelo MALDI-TOF MS. Após padronização da técnica as amostras K1, K2, K3, 7008 e 51281 foram analisadas por essa metodologia. Os isolados clínicos de K. pneumoniae 7726 e 7461 que não expressavam as porinas OmpK35 e a OmpK36 foram selecionados e submetidos a transformação pela técnica de eletroporação. Uma cepa de K.pneumoniae portadora do plasmídeo pSHA2 carreador do gene ompK36 foi utilizado para transferir o gene dessa porina originando os DLs 7726-1 e 7461-4. A expressão e avaliação do perfil proteico dos isolados transformados foi avaliado por extração plasmidial e, assim, como os isolados clínicos que foram avaliados pelas técnicas de SDS-PAGE, qRT PCR, PCR e sequenciamento, e comparado com a detecção da OmpK36 pela técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF. Resultados: Após a introdução da OmpK36 por transformação, os respectivos DLs 7726-1 e 7461-4 apresentaram um pico proteico de 37,5 kDa pela técnica de MALDI-TOF MS. A transferência foi fortemente evidenciada pela inclusão de uma nova banda no gel de SDS-PAGE com aproximadamente 36 kDa e a expressão relativa da OmpK36 nos DLs 7726-1 e 7461-4, que foram respectivamente 2.919 e 1.993 vezes superiores que as cepas originais 7726 e 7461, respectivamente. Nos isolados clínicos, a expressão da OmpK36 pela espectrometria de massa evidenciou o pico de massa ao redor de 37 m/z. A detecção dessa OMP por espectrometria de massa apresentou alta reprodutibilidade quando os extratos proteicos foram analisados em períodos diferentes. Conclusão: A técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF demonstrou ser rápida, acurada e reprodutível para determinar o perfil proteico da OmpK36.