Inibição da via JAK/STAT em linhagens celulares de mieloma múltiplo como potencial alvo terapêutico - Oliveira, Mariana Bleker de [UNIFESP] (2017)
Introdução: A ativação constitutiva das proteínas JAK em mieloma múltiplo (MM) promove a sobrevivência e proliferação de células tumorais. O bloqueio das proteínas JAK pode contribuir para reduzir os efeitos auxiliares da sinalização aberrante nas células de mieloma e a inibição farmacológica das JAKs pode, portanto, ser uma estratégia terapêutica para o tratamento do mieloma. Objetivos: 1) Identificar, em linhagens celulares de MM, a existência de expressão relevante dos genes da via JAK/STAT JAK1 e JAK2 e validar os achados em amostras de pacientes recém-diagnosticados com MM; 2) Realizar estudos funcionais in vitro com as linhagens celulares de MM previamente selecionadas, em monocultura e co-cultura com células estromais normais, tratadas com um inibidor da via JAK/STAT (ruxolitinibe), associado a outras drogas utilizadas atualmente no tratamento de primeira linha do MM; 3) Avaliar a expressão global dos genes da via JAK/STAT e de proteínas de interesse em linhagens celulares de MM previamente selecionadas, selvagens e tratadas in vitro com o inibidor da via JAK/STAT. Métodos: A expressão dos genes JAK1 e JAK2 foi analisada por PCR em tempo real (qPCR). Para os experimentos in vitro, com ruxolitinibe, bortezomibe, e a combinação das duas drogas, as concentrações foram determinadas após verificação de qual dose é capaz de induzir pelo menos 50% de morte celular. A apoptose (marcação com anexina V e iodeto de propídeo) e o ciclo celular (marcação com iodeto de propídeo) foram analisados por citometria de fluxo. O PCR array para a via JAK/STAT foi avaliado em duplicatas com células tratadas com a combinação de ruxolitinibe e bortezomibe e não tratadas e o valor do fold change (2-ΔΔCt) foi calculado para todos os genes. As proteínas Beclina-1 (autofagia) e XBP-1s (UPR) foram escolhidas para avaliação por Western Blot. Resultados: A linhagem RPMI-8226 apresentou menor expressão do gene JAK1, quando comparada à linhagem U266, e não houve diferença estatisticamente significante para a expressão do gene JAK2. Dos 30 pacientes recém-diagnosticados com MM, 57% apresentaram hiperexpressão de JAK2 e 21%, de JAK1. Porém, a expressão de JAK1 e JAK2 não apresentou correlação com a sobrevida ou com as características clínico-laboratoriais dos pacientes. As concentrações utilizadas para a combinação das drogas foram: ruxolitinibe (30 μM para RPMI-8226 e 40 μM para U266) e bortezomibe (10 nM). Após 72 horas de tratamento com a combinação de ruxolitinibe e bortezomibe (R+B), as linhagens RPMI-8226 e U266 apresentaram 50% de células em apoptose tardia. A morte celular nas duas linhagens foi acompanhada por diminuição de expressão dos genes anti-apoptóticos após tratamento com R+B. A linhagem RPMI-8226 apresentou maior número de células na fase SubG0 (p<0,001) após tratamento com R+B e redução de células nas fases S (p<0,01) e G2/M (p<0,001). A linhagem U266 não apresentou alterações no ciclo celular, exceto por um pequeno aumento de células na fase SubG0 (p<0,05). A co-cultura com células estromais protegeu as células RPMI-8226 tratadas com combinação de R+B da apoptose, já que a porcentagem de células em apoptose caiu para 32% (p<0,001), em relação à monocultura. A adição da droga imunomoduladora lenalidomida reverteu o efeito protetor conferido pelas células estromais, já que a combinação de ruxolitinibe, bortezomibe e lenalidomida causou 62% de morte celular nas células tumorais (p<0,05). O tratamento em co-cultura com ruxolitinibe, bortezomibe e lenalidomida foi equivalente ao tratamento com bortezomibe, lenalidomida e dexametasona, combinação utilizada na prática clínica. O perfil de expressão dos genes da via JAK/STAT nas células tratadas com R+B, quando comparado ao perfil das respectivas linhagens selvagens, mostrou diminuição de expressão de genes das vias JAK/STAT, Ras/Raf/MAPK e PI3K/Akt/mTOR, principalmente na linhagem RPMI-8226, com mudanças insignificantes no padrão de expressão da linhagem U266. Após tratamento com R+B, houve aumento na expressão proteica de XBP-1s. Conclusão: Neste trabalho, demonstramos que existe aumento de expressão do gene JAK2 em quase 60% dos pacientes com MM, além dos efeitos do inibidor de JAK1/2, ruxolitinibe, na apoptose tardia, ciclo celular e expressão de genes da via JAK/STAT, em pelo menos uma das linhagens celulares de MM. Nesse cenário, a via JAK/STAT pode configurar como um alvo terapêutico a ser explorado, já que se encontra constitutivamente ativa em uma porcentagem relevante de pacientes e contribui para a sobrevivência de células tumorais do MM.