Solubilização de misturas lipídicas ternárias do tipo raft por detergentes não-iônicos - Carita, Amanda Costa [UNIFESP] (2015)
O processo de solubilização de membranas biológicas é relevante para inúmeros protocolos bioquímicos. Em determinadas condições, algumas membranas apresentam resistência à solubilização, mesmo sob alta concentração de detergente. Esses fragmentos insolúveis, chamados de DRMs (membranas resistentes a detergentes), são ricos em esfingolipídios, colesterol e proteínas com preferência por ambientes mais organizados. A composição dos DRMs é similar à dos rafts, que são domínios funcionais de membrana envolvidos em diversos mecanismos celulares importantes, e à da fase líquido-ordenada de bicamadas lipídicas. Devido à complexidade do estudo dos rafts in vivo, as membranas modelo representam uma interessante opção para elucidar seu funcionamento. Aqui, realizamos o estudo de aspectos físico-químicos que regem o processo de solubilização de misturas lipídicas ternárias compostas pelos lipídios POPC (palmitoil oleoil fosfatidilcolina, um lipídio insaturado), SM (esfingomielina, um lipídio saturado) e colesterol em uma grande gama de composições. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) e grandes (LUVs) foram escolhidas como modelos de membrana para os ensaios de solubilização. O principal detergente utilizado neste trabalho foi o Triton X-100 (TX-100), amplamente empregado como agente solubilizador de membranas biológicas. Adicionalmente, os detergentes Brij 98, maltosídeo e octil-glicopiranosídeo (OG) também foram investigados. A principal técnica utilizada foi a microscopia óptica de GUVs. Em paralelo, alguns estudos de fluorescência e espalhamento de luz foram feitos em LUVs. Este trabalho teve como objetivo principal verificar se o TX-100 induzia a separação de fases líquido-desordenada/líquido-ordenada e quantificar a extensão de solubilização, à medida que a proporção dos lipídios era alterada na composição ternária. Foi possível observar que a adição de TX-100 aumenta consideravelmente a região de coexistência de fases macroscópica e a presença de SM e col tornam a mistura cada vez mais insolúvel. A técnica de FRET foi empregada para verificar a existência de domínios sub-microscópicos e compreender se a adição de detergente ampliava os domínios pré-existentes ou induzia sua formação. O espalhamento de luz estático também foi utilizado para monitorar o perfil de solubilização na mesma amostra. 5 Ademais, GUVs compostas por POPC puro e POPC:SM:col (4:2:4) foram escolhidas para estudos por microscopia óptica com os detergentes OG, maltosídeo e Brij 98. O foco aqui foi comparar os efeitos observados com o TX-100 com os demais detergentes não-iônicos. No processo de solubilização de GUVs de POPC ficou evidente como a natureza química do detergente influencia no processo de solubilização: o TX-100 possui a capacidade de ser incorporado em grande quantidade na bicamada e de solubilizá-la completamente. A partição do OG na membrana parece ser menor e seu caráter solubilizador foi menor, pois fragmentos insolúveis foram verificados. O maltosídeo, cuja cabeça polar é composta por um dissacarídeo, levou à ruptura da vesícula e o Brij 98 apresentou uma pequena partição na membrana mas não foi capaz de solubilizá-la. Os resultados com as GUVs de composição ternária mostraram que além do TX-100, os detergentes maltosídeo e OG induziram a formação de domínios, mas em proporções distintas dependendo do detergente. Dessa maneira, apesar de o uso de detergentes ser um fator importante para o estudo dos lipid rafts não é possível realizar uma associação direta entre as frações insolúveis resultantes desse processo e os rafts de membrana in vivo.