Vacinação com a proteína 2 da superfície de amastigotas contra a infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi: eficácia de diferentes estratégias vacinais e mecanismos de imunidade - Alencar, Bruna Cunha Gondim de [UNIFESP] (2009)
A imunização genética com um DNA plasmidial, contendo o gene que codifica a proteína 2 da superfície de amastigotas (ASP-2), é capaz de proteger parte dos camundongos altamente suscetíveis A/Sn contra uma infecção letal pelo Trypanosoma cruzi. Com base neste resultado, a hipótese central desta tese foi a de que se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações. Para tal, empregaram-se protocolos de imunização e reforço homólogo ou heterólogo, usando DNA plasmidial, proteínas recombinantes, e vírus recombinantes da ASP-2 de T. cruzi. Inicialmente, testou-se se o reforço heterólogo com a proteína ASP-2 recombinante aumentava a eficácia da vacinação com o DNA plasmidial (pIgSPCl.9). Este protocolo não se mostrou mais eficaz, mas abriu a possibilidade de que a imunização com a proteína ASP-2 recombinante pudesse ser utilizada como um protocolo vacinal alternativo. Com esta abordagem, descreveu-se que a administração de 3 doses de uma proteína recombinante (GST-P4P7), representando os aminoácidos 261-500 da ASP-2 em fusão com a glutationa S-transferase, na presença dos adjuvantes alum e CpG ODN 1826, era capaz de induzir altos níveis de proteção. Neste modelo experimental, observou-se que a imunidade protetora foi de longa duração e dependente dos linfócitos CD8 específicos para o epítopo imunodominante TEWETGQI. Determinou-se também que o adjuvante CpG ODN 1826 melhorou a eficácia da imunidade protetora, e que linfócitos T CD4 específicos são importantes para a indução dos linfócitos CD8 protetores. Como o protocolo de vacinação com a proteína recombinante GST-P4P7 exigia o uso de três doses, testou-se então a possibilidade de que um adenovírus recombinante, expressando a ASP-2 (AdASP-2), pudesse ser utilizado num protocolo de imunização e reforço homólogo ou heterólogo (somente duas doses). Na comparação dos protocolos de vacinação homólogos ou heterólogos com pIgSPCl.9 e AdASP-2, observou-se que, nos animais A/Sn, tanto a imunização homóloga quanto a heteróloga, usando o AdASP-2, proporcionaram um alto grau de imunidade protetora contra a infecção pelo T. cruzi. Os estudos utilizando o protocolo heterólogo (pIgSPCl.9 seguido por AdASP-2), que protege 80-100% dos camundongos, mostraram que a imunidade era de longa duração e dependente dos linfócitos T CD4 e CD8. Esta imunidade protetora se correlacionou com a atividade citotóxica específica in vivo, antes do desafio com o T. cruzi. Com base nestes resultados, analisou-se a imunidade protetora após a vacinação heteróloga em camundongos com deficiência de um importante mediador da citotoxicidade, a perforina. Os animais deficientes (KO) da expressão de perforina vacinados se mostraram suscetíveis à infecção experimental. Uma análise da resposta imune celular destes camundongos mostrou que eles apresentavam uma menor produção de IFN-γ por esplenócitos re-estimulados in vitro, na presença do antígeno recombinante. Na análise dos linfócitos T CD8 específicos observou-se que havia: i) uma expansão numérica normal; ii) uma redução numérica significativa dos linfócitos multifuncionais, capazes de expressar simultaneamente IFN-γ/CD107a e IFN-γ/TNF-α.; iii) baixa citotoxicidade in vivo; iv) baixa expressão de CD44 e de KLRG-1. Por fim, para definir a importância relativa do IFN-γ e da citotoxicidade na proteção contra a infecção pelo T. cruzi após a vacinação heteróloga, camundongos IFN-γ KO foram imunizados com pIgSPCl.9 seguido por AdASP- 2. Estes animais apresentaram um alto grau de citotoxicidade in vivo, mas nenhuma imunidade protetora detectável. Em resumo, ao longo deste trabalho obtiveram-se evidências que confirmam a hipótese inicial de que, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações, se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi. Pela utilização de depleções in vivo e de animais geneticamente deficientes, definiu-se a importância dos linfócitos T CD4 e CD8, da perforina e do IFN-γ na imunidade gerada pela vacinação com a ASP-2 de T. cruzi. Acredita-se que os dados obtidos no decorrer desta tese serviram para: i) uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos de resistência à infecção pelo T. cruzi e dos seus antígenos alvos; ii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra infecções por protozoários intracelulares em geral e, especificamente, contra a doença de Chagas; iii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes capazes de induzir uma potente resposta imune mediada por linfócitos T.