Geração de espécies reativas de oxigênio pela NOX4 em células de câncer colorretal humano: papel do óxido nítrico na regulação da NOX4 por s-nitrosilação - Teodoro, Ana Caroline de Souza [UNIFESP] (2021)
No câncer colorretal (CCR), um pior prognóstico está relacionado à produção das espécies reativas de oxigênio (ROS) peróxido de hidrogênio (H2O2) e ânion superóxido (O2-) e do óxido nítrico (NO). Notadamente, as principais fontes geradoras de NO e ROS nestes tipos de tumor são, respectivamente, as enzimas isoforma induzível da NO sintase (NOS2) e NADPH Oxidase 4 (NOX4). Assim, lançamos a hipótese de que diferentes estágios do CCR transitam, sob o controle de uma modulação temporal da produção de ROS e NO. Parte desta regulação fina pode acontecer a partir de uma ação sinalizadora do NO que introduziria uma modificação pós-tradução na enzima NOX4, a S-nitrosilação de resíduos específicos de cisteína, resultando em inibição da produção de ROS. Utilizando como modelo três diferentes linhagens de tumores de CCR humanos (SW480, SW620 e HCT116), que mimetizam os estágios da progressão tumoral. Inicialmente determinamos as concentrações de ROS e NO nas linhagens celulares mantidas na presença e ausência de soro bovino fetal (SBF) no meio de cultura. A condição de ausência de SBF foi considerada aquela que melhor mimetiza as condições encontradas in vivo pelas células de CCR. A produção de NO foi determinada a partir do acúmulo de seus subprodutos NO2- e NO3- em meio suplementado ou livre de SBF no período de 48 horas. Os resultados mostram que o acúmulo de NO em meio é dependente do tempo, uma vez que há um acúmulo maior de seu produto de oxidação NO2- após 48h. As células SW620, independentemente do tempo de incubação, presença ou ausência de SBF, apresentaram maiores concentrações de NO2- quando comparadas às demais. Ficou demonstrado que as células SW620 produzem mais O2- em comparação às células SW480. Em células SW620, as concentrações de H2O2 foram menores quando comparadas às concentrações desta espécie reativa em células SW480. A produção de H2O2 foi maior nas células SW480. Realizando técnicas de imunodetecção (westernblot, imunoprecipitação), analisamos a expressão proteica das enzimas NOX4 e NOS2 nas linhagens mencionadas onde determinamos que a expressão das duas enzimas, depende da presença ou ausência de SBF no meio de cultura. Para identificar NOX4 s-nitrosilada (SNO-NOX4), realizamos ensaios de ligação por proximidade, e ensaios de imunoprecipitação seguido de western blot revelado com anticorpo anti-biotina, objetivando aumentar as chances de detecção de proteína nitrosilada. Nestes ensaios encontramos SNO-NOX4, nas linhagens estudadas. O conjunto destes resultados sugere que as células SW480 apresentavam SNO-NOX4 em condições basais e que as células SW620 apresentavam SNO-NOX4 associada à elevação dos níveis endógenos de NO, promovida pela retirada de SBF do meio de cultura celular. SNO-NOX4 foi detectada em células HCT116 nas duas condições de cultivo. Mais estudos são necessários para validar nossa hipótese e/ou confirmar que células de CCR metastáticas como as células SW620 teriam SNO-NOX4 como mecanismo de controle negativo para geração de ROS e assim manter a homeostase redox intracelular nestas células.