Descoberta de compostos com amplo espectro contra Trypanosoma cruzi por meio de triagem de alto conteúdo - Franco, Caio Haddad [UNIFESP] (2018)
A tecnologia de high content screening (HCS) permite a triagem de uma grande quantidade de moléculas dentro de um período relativamente curto de forma eficiente e robusta. Sabendo que o Trypanosoma cruzi é promíscuo em relação a infecção de células hospedeiras de mamíferos para ensaios in vitro, praticamente qualquer célula nucleada pode ser usada para triagem fenotípica. No entanto, a dinâmica celular e as interações parasito-hospedeiro podem desempenhar um papel importante nos resultados de triagem e seleção de compostos. Além disso, T. cruzi é uma espécie heterogênea subdividida em seis grupos filogenéticos distintos que também podem apresentar variabilidade na susceptibilidade aos diferentes compostos testados in vitro e in vivo. Um ensaio de HCS para a forma intracelular de diferentes cepas de T. cruzi e em tipos de células hospedeiras distintas foi desenvolvido e validado. Em seguida uma biblioteca contendo compostos foi submetida ao processo de triagem no qual foi identificado e confirmado um composto análogo a auraquina D, com atividade inédita anti-T. cruzi. Em relação ao ensaio com diferentes cepas, a biblioteca Pathogen Box foi triada contra as cepas de T cruzi Sylvio X10/1, Y clH10 e CL Brener, apresentando um perfil distinto de atividade para cada uma. Das 400 amostras testadas, os compostos MMV689028, MMV689029 MMV688958 e MMV688795 foram os únicos selecionados contra as três cepas. Apesar de conhecidas como agentes anti-kineoplastídeos, o amplo espectro de ação dessas moléculas contra as cepas de T. cruzi nunca havia sido explorado. A fim de verificar o efeito da célula hospedeira utilizada no ensaio de alto conteúdo, e sua consequência na seleção de hits, 1.280 compostos foram testados contra amastigotas infectando células das linhagens U2OS, THP-1, VERO e L6. Observamos que existe uma sobreposição muito baixa de compostos selecionados quando células hospedeiras distintas são utilizadas em screening de compostos contra T. cruzi. Os ensaios confirmatórios destacaram os compostos CB1954, FPL64176, AEG3482 e entecavir pela potência e seletividade satisfatórias. Uma outra abordagem na qual empregamos a técnica de high content screening foi o estudo de resistência de T. cruzi aos compostos azólicos e inibidores de CYP51, proposto por muitos como um alvo validado para a quimioterapia de doença de Chagas. Um clone da cepa Y foi cultivado sob concentrações crescentes de ravuconazol, até atingir estabilidade in vitro sob 500 nM. O clone resistente exibiu uma taxa de infecção reduzida e um baixo número de amastigotas intracelulares, quando comparado ao clone parental, in vitro. O clone resistente também apresentou um processo de epimastigogênese lento e diminuiu o tempo de duplicação de população de epimastigota. Nos ensaios de atividade de fármacos, o ravuconazol foi pelo menos 1.000 vezes menos potente no clone resistente e o fenótipo foi mantido mesmo após várias semanas sem a pressão do composto e também após submeter o parasita a um ciclo de vida completo in vitro. O clone resistente ao ravuconazol também mostrou resistência cruzada a outros inibidores azólicos e não azólicos da CYP51, mas não aos nitroheterocíclicos benznidazol e nifurtimox, que agem sob outro mecanismo de ação. Uma nova mutação na TcCYP51 foi identificada no clone resistente. Espera-se que estes resultados auxiliem no entendimento da resistência natural de algumas cepas de T. cruzi aos inibidores de CYP51 e permita um maior entendimento do papel das isoformas de CYP51 na biologia do parasita. Os resultados obtidos nesse estudo apontam para novas perspectivas na descoberta e desenvolvimento de fármacos para doença de Chagas.