Análise molecular do plasma seminal de pacientes com lesão medular, baseada em espectrometria de massas: proteômica quantitativa e fosfoproteômica - Silva, Barbara Ferreira da [UNIFESP] (2015)
Objetivo: Este trabalho visa à caracterização molecular do plasma seminal obtido de pacientes com anejaculação causada por lesão medular (LM). Método: Amostras de plasma seminal foram coletadas, de 12 pacientes LM por estimulação vibratória peniana (EVP) e 11 doadores controle não lesionados e normozoospérmicos. A concentração de proteína de cada amostra foi estimada através do método de Bradford. Todas as amostras de indivíduos controle foram agrupadas formando um pool de proteínas (1mg total) representativo do grupo. As amostras LM ou foram agrupadas em pool representativo contendo 1mg de proteínas totais (10 amostras) ou analisadas individualmente (12 amostras, 1mg/amostra). Todas as amostras foram submetidas a uma digestão sequencial de proteínas combinando endoproteinase Lys-C com tripsina e os peptídeos resultantes foram quimicamente marcados por reação de dimetilação com isótopos estáveis, de acordo com o grupo. As principais diferenças entre os grupos foram acessadas através da comparação de pool de amostras ("experimento pool?), à medida que variações específicas entre indivíduos foram investigados através da análise de amostras individuaís ("experimento individual?). Assim, os peptídios marcados foram agrupados em proporção 1:1 (pool controle:pool LM; pool controle:amostra individual) e a mistura final submetida a fracionamento off-line. Um total de 48 frações foram coletadas para a "experimento pool" e 36 frações (combinadas em 30 frações) para o "experimento individual." Todas as frações coletadas foram finalmente analisadas por espectrometria de massas (MS) em tandem (MS/MS). Para análise de fosfoproteômica, as amostras diferencialmente marcadas por reação de dimetilação foram inicialmente misturadas, digeridas a peptídeos e aplicadas em uma coluna de Fe-IMAC acoplada a um sistema de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) para o enriquecimento dos fosfopeptídeos. Em seguida, a amostra foi fracionada e posteriormente analisada por MS/MS. Resultados: Em relação ao experimento de proteômica quantitativa, obteve-se uma ampla caracterização do proteoma do plasma seminal humano, identificando-se mais de 2.800 proteínas únicas, além de descrever, em detalhes, o proteoma diferencial observado em pacientes LM. A análise funcional do proteoma demonstrou que uma hiper-ativação do sistema imunológico, a qual não é desencadeada por infecção microbiana, pode influenciar em alguns processos seminais importantes. Além disso, os resultados apontam em direção a uma relevante falha funcional prostática, intrinsecamente relacionada à baixa motilidade dos espermatozoides, observada em pacientes LM. À baixa funcionalidade prostática está ligagada a diminuição de enzimas metabólicas, responsáveis pela produção de ATP extracelular, secretadas via prostasomos. Em relação ao experimento de fosfoproteômica, no total 33 diferentes fosfoproteínas foram identificadas, correspondendo a 428 fosfopeptídeos. Ao todo, cerca de 116 diferentes sítios de fosforilação, com um mínimo de 2 peptídeos e 1% FDR foram identificados. Através da comparação quantitativa entre pacientes LM e contoles, foi possível observar que um total de 14 fosfoproteínas individuais apresentou-se elevado no grupo LM, ao passo que 9 fosfoproteínas apresentaram-se diminuídas no memso grupo. Um total de 53 sítios de fosforilação no grupo LM e um total de 40 sítios de fosforilação no grupo controle foram identificados. Entretanto, os resultados mais expressivos foram observados em relação à semenogelinas. Foram identificados, com confiança, 29 novos sítios de fosforilação em semenogelinas (14 sítios descritos para SEMG1 e 15 sítios descritos para SEMG2). Para SEMG1, cerca de 7 sítios de fosforilação encontraram-se elevados no grupo LM. Não obstante, 6 diferentes sítios de fosforilação encontraram-se diminuídos no grupo LM . Para SEMG2, cerca de 5 sítios de fosforilação foram encontrados elevados no grupo LM, ao passo que 10 sítios de fosforilação encontraram-se diminuídos nesse grupo. Tais resultados levantam a hipótese de que, assim como a próstata, as vesículas seminais de pacientes LM podem apresentar anormalidades funcionais e estarem envolvidas na baixa qualidade seminal apresentada por esses pacientes. Conclusões: Este estudo descreveu a infertilidade relacionada à LM, em um nível proteômico, evidenciando os principais fatores que podem comprometer a funcionalidade dos espermatozoides, principalmente, a motilidade celular. Cerca de 2.800 proteínas foram identificadas com alta confiança, evidenciando que pacientes LM apresentam forte atividade do sistema imunológico, não acionado por infecção microbiana. Há, também, uma indução de inibidores de proteases e uma perda simultânea de proteases. No entanto, a possível perda de função da próstata talvez seja o principal responsável por causar o fenótipo molecular e macroscópico, observado na infertilidade decorrente de LM. Além disso, este estudo descreveu o fosfoproteoma do plasma seminal humano, em detalhe. O estudo de diferentes padrões de fosforilação pode, também, facilitar a compreensão dos mecanismos que levam à infertilidade decorrente de LM. Os resultados evidenciaram que pacientes LM apresentam muitas fosfoproteínas relacionadas às vesículas seminais. Talvez o padrão de fosforilaç?o diferencial esteja relacionado a problemas de funcionamento glandulares decorrentes da propria LM.