Estudo in vitro da relação entre a ativação celular e a variação genética do HIV-1 - Silva, Cristiano Teodoro da [UNIFESP] (2005)
A pandemia de HIV / Aids tem sido um dos maiores desafios de Saúde publica dos ultimos 25 anos, dada a complexidade de seu agente etiologico e a rapidez com que produz novos casos. A variabilidade genetica do HIV e um dos topicos mais relevantes desta infeccao e esta variabilidade genetica resulta de limitacoes de fidelidade intrinsecas ao mecanismo de replicacao viral, acentuados pela alta taxa de replicacao na geracao e eliminacao de particulas virais durante o tempo da infeccao. A transcricao reversa do genoma viral representa uma etapa critica do ciclo biologico do HIV -I e que pode softer a influencia de varios fatores, como por exemplo a oferta de nucleotideos ou o estado de ativacao celular. Este deficit de oferta de nucleotideos no momento da transcricao reversa pode gerar genomas altamente mutados nos quais, a informacao viral se perde como no caso da hipermutacao. Neste estudo propomos estudar in vitro os mecanismos que podem contribuir pela diversidade genetica do HIV nos momentos iniciais da infeccao em celulas mononucleares de sangue periferico (PBMCs) de individuos saudaveis. Para tanto, ofertamos tres diferentes condicoes de infeccao e cultura para o HIV. Na primeira, infectamos PBMe's em repouso e mantivemos em cultura por 48h; na segunda as PBMCs foram infectadas e ativadas simultaneamente e mantida em cultura por 48h; na terceira condicao, as PBMCs foram ativadas 72h antes da infeccao, apos, infectadas e mantidas em cultura por 48h. Utilizando a tecnica do EndPoint PCR, DNA provirais oriundos de cada condicao de cultura foram obtidos e 46 clones deste DNA produzidos. Em seguida, parte do gene pol contendo 1047 bp de todos os clones foi sequenciado e analisado. Nossos resultados mostraram uma alta taxa de substituicoes de nucleotideos ao longo das sequencias analisadas em todas as condicoes de cultura e a existencia de regioes comuns entre estas sequencias, em todas as condicoes, em que ocorrem substituicoes, destacando as regioes entre 200 a 300 pb, 400 a 500 pb, 600 a 690 pb, 800 a 900 pb. Nestas regioes o processo mutacional e intenso, os eventos mutacionais que mais ocorrem sao os de transicao e as substituicoes nucleotidicas mais fteqUentes sao as de G para A. Ha clones hipermutados nas tres condicoes e a taxa mutacional encontrada esta em um intervalo de I,OxlO-3 a 2,lxlO-2, valores muito acima do que os encontrados normalmente. Nossos resultados sugerem uma nova visao dos momentos iniciais da infeccao pelo HIV -I. Estudos complementares poderao nos ajudar a entender de forma coesa os momentos iniciais da infeccao pelo HIV -I que, sem duvida representa um evento crucial na evolucao da doenca