Avaliação das mudanças morfológicas e perfis fosfolipídicos de formas de Leishmania (Leishmania) amazonensis induzidas por variações de pH e temperatura nas condições de cultivo - Maciel, Leticia de Oliveira (2021)
Leishmania apresenta dois estágios no ciclo de vida desenvolvidos em microambiente distintos. Nos insetos os parasitas encontram-se no trato digestivo e no hospedeiro vertebrado no vacúolo parasitóforo de células do sistema monocítico fagocitário. No presente estudo avaliou-se os efeitos de temperatura e pH, em culturas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, quanto a morfologia dos parasitas, secreção de vesículas e expressão de fosfolipídeos. Os estudos foram realizados com formas promastigotas isoladas no início da fase estacionária e cultivadas por 48h em duas condições: i) controle, a 23 ̊C em meio pH 7,2 (mimetizando as condições do vetor invertebrado), e ii) em meio pH 5,5 a 35°C (mimetizando as condições dos fagolisossomos). Por microscopia confocal e microscopia eletrônica de varredura, diferenças morfológicas foram observadas já nas primeiras 12h após a transferência dos parasitas para meio acídico a 35˚C, com redução do tamanho do corpo e flagelo, e aparecimento de vesículas na superfície dos parasitas. Após 48h em meio pH 5,5 a 35˚C os parasitas se apresentaram com forma ovoide, com redução significante do comprimento do corpo e flagelo, cerca de 3,2 e 14 vezes, respectivamente. Esses parasitas foram caracterizados morfologicamente como “amastigota-like”. Após 48h observou-se aumento expressivo do número de vesículas na superfície dos “amastigotas-like”, essas vesículas não estavam presentes em parasitas mantidos pelo mesmo período de tempo em meio pH 7,2 a 23˚C. A presença de vesículas extracelulares foi avaliada em sobrenadante de 48h. Estas vesículas foram purificadas por centrifugações sequenciais e analisadas por microscopia de varredura. Somente os sobrenadantes das culturas em meio pH 5,5 a 35˚C apresentaram vesículas, com diâmetro médio de 63 nm, tamanho característico de exossomos. A expressão de inositolfosforilceramida (IPC) durante a diferenciação de promastigotas a “amastigotas-like” foi avaliada por microscopia confocal com o anticorpo monoclonal LST-1, anti-IPC. Forte marcação com LST-1 foi observada na membrana plasmática e em organelas intracelulares ainda não caracterizadas. Concomitantemente com a redução do tamanho do parasita, observou-se uma menor redução da marcação dos parasitas com LST-1. A expressão dos fosfolipídeos foi analisada, tanto em promastigotas quanto em “amastigotas-like”, foi analisada. Lipídeos foram extraídos dos parasitas, purificados e quantificados por cromatografia em camada delgada de alta resolução. Os “amastigotas-like” apresentam cerca de duas vezes menos fosfolipídeos que os promastigotas, considerando-se massa de fosfolipídeos/parasita, o que pode ser explicado pela redução do tamanho dos parasitas e secreção de vesículas pelos parasitas. Em relação a expressão de fosfolipídeos não detectamos diferenças significativas entre os perfis. Considerando-se as classes de fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol e inositolfosforilceramida entre as formas promastigotas e “amastigotas-like”, apesar de ter sido observada uma tendência de redução da expressão de IPC nos “amastigotas-like”, esfingolipídeo pouco expresso em amastigotas de lesão. Estudos ainda devem ser conduzidos visando análise mais detalhada sobre as diferentes espécies de cada classe, por espectrometria massas. Nossos resultados mostram claramente que a diferenciação do promastigotas em meio acídico em temperatura de 35˚C é acompanhada de extensa secreção de vesículas, com a redução do tamanho do parasita e do flagelo.