Mecanismos de resistência à morte por Anoikis mediada por óxido nítrico em células de melanoma humano - Nascimento, Igor Ribeiro [UNIFESP] (2022)
O melanoma caracteriza-se pelo crescimento descontrolado dos melanócitos. E, embora seja menos comum do que outros tipos de câncer de pele (American Cancer Society, 2021) é a forma mais mortal entre eles, exibindo padrões de desenvolvimento extremamente agressivos. Sua taxa de sobrevida em 5 anos é inferior a 5% para os pacientes com melanomas metastáticos para os linfonodos. Um processo de metástase bem-sucedido está associado à capacidade de resistir à morte por perda de adesão ao substrato (anoikis), que melanomas e outros tumores adquirem durante seu desenvolvimento. Dentre uma série de fatores que podem influenciar a morte por anoikis, o papel do óxido nítrico (NO) ainda foi pouco explorado. O NO produzido ou ofertado em baixas concentrações estimula a proliferação de células aderidas a matriz extracelular (MEC).Por outro lado, nestas mesmas condições, o NO produzido ou ofertado em concentrações elevadas pode promover a morte celular. No entanto, em células onde a adesão a MEC foi impedida com indução de morte por anoikis, sabe-se pouco sobre o papel do NO. Nossos primeiros resultados evidenciaram que a utilização de uma superfície de cultivo celular revestida com 20mg/ml de Poli-Hema promovia total incapacidade de adesão das células A375 e SK-MEL-28 de melanoma humano. Estas condições promoviam a morte por anoikis nas células das duas linhagens. As células das duas linhagens quando em suspensão entravam em anoikis em diferentes proporções: Células A375 com mortalidade de 58,6% e células SK-MEL-28 com mortalidade de 34,3%. Utilizamos inicialmente a oferta de NO a partir do doador Detanonoato e a retirada de NO com o uso do seu sequestrador específico, CPTIO. Os resultados obtidos com esta abordagem nos levaram a procurar entender um possível papel para o NO produzido endógenamente pelas duas linhagens. Fizemos uma estimativa de produção endógena de NO e os resultados obtidos mostraram que essa produção nas células A375 se mantinha elevada estando as células aderidas ou mantidas em suspensão. Para as células SK-MEL-28 a produção de NO se encontrava elevada nas células aderidas e diminuída nas células em suspensão. Quando as células eram tratadas com o inibidor geral das enzimas NO sintases (NOS) a viabilidade das células A375 mantidas em suspensão caía de 41,4% para 10,6%, enquanto que para as células SK-MEL-28 em suspensão a viabilidade se mantinha inalterada, de 65,7% para 65,5%. Estes resultados demonstraram que NO desempenha papel muito importante na resistência a anoikis apresentada pelas células A375. Por outro lado parece não influenciar na resistência a anoikis apresentada pelas células SK-MEL-28. Com base nesses resultados investigamos as possíveis fontes de NO nas células A375. Nossos resultados sugeriram que uma possível fonte endógena de NO nestas células, utilizável na resistência a anoikis, poderia ser a isoforma NOS3. Em relação aos impactos do NO na expressão das proteínas diretamente relacionadas a anoikis como Bim e a forma clivada/ativa de Caspase 3, não observamos maiores alterações nas células das duas linhagens. Quando analisamos as expressões de proteínas reguladoras da anoikis, Caveolina-1 e a proteína tirosina quinase do complexo de adesão focal (FAK), observamos uma diminuição nos níveis de expressão de Caveolina-1 nas células das duas linhagens mantidas em suspensão. Entretanto, não se observam para as duas linhagens, diferenças entre as três condições experimentais analisadas: células em suspensão; células em suspensão tratadas com PBS (diluente do inibidor das NOSs); células em suspensão tratadas com L-NAME. Os níveis de expressão e de fosforilação da proteína FAK diminuíram nas células A375 mantidas em suspensão e tratadas com L-NAME. Mais ainda, observamos consistentemente em células A375 que as expressões de b-actina e a-tubulina diminuíam quando estas células eram mantidas em suspensão e tratadas com L-NAME. Concluindo, os resultados obtidos neste estudo sugerem a existência de uma via de sinalização celular associada à resistência a anoikis em melanomas humanos de sítio primário, mediada pelo NO. Esta via seria constituída pela proteína tirosina quinase FAK e pelas proteínas constituintes da MEC, b-actina e a-tubulina.