Lise celular e ativação da trialisina, proteína citolítica da saliva de Triatoma infestans - Martins, Rafael Miyazawa [UNIFESP] (2007)
A saliva de artrópodos hematófagos constitui um coquetel farmacológico que atua nos sistemas hemostático, inflamatório e imunológico de seus hospedeiros para auxiliar a aquisição do sangue. O inseto T. infestans, vetor da doença de Chagas, apresenta em sua saliva uma série de moléculas e atividades biológicas já descritas. Dentre elas está a trialisina, uma proteína formadora de poros em bicamadas lipídicas. A trialisina é capaz de lisar/permeabilizar diversos tipos celulares e se propõe que a atividade lítica ocorra pela inserção da porção N-terminal da molécula na membrana das células de tal forma a promover a formação de um poro. A identificação do gene que codifica a trialisina mostrou que além de ter uma seqüência sinal de secreção, a proteína conteria uma região ácida no seu N-terminal. Este domínio está ausente na proteína madura purificada da saliva e poderia inibir a ação da trialisina. O objetivo de nosso trabalho foi estudar o mecanismo de lise da trialisina e como se daria a ativação do precursor da trialisina (pró-trialisina) durante a secreção da glândula salivar até a ejeção da saliva. Para entender o mecanismo de ação da trialisina, já que a expressão heteróloga tanto da pró-trialisina quanto da trialisina apresentou várias dificuldades, utilizamos peptídeos sintéticos baseados na região N-terminal da trialisina madura. Os peptídeos mostraram diferentes especificidades para tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, hemácias humanas e Escherichia coli, mas de modo geral, aqueles que continham a maior parte da primeira hélice anfipática predita na trialisina madura apresentaram maior atividade lítica. Todos os peptídeos adquiriam estrutura secundária (α-hélices) na presença de agentes miméticos de membranas. Determinamos as estruturas tridimensionais em solução por Ressonância Magnética Nuclear dos três peptídeos mais ativos e de um pouco ativo e pudemos observar a importância de segmentos distintos de alguns peptídeos nas especificidades dos alvos. 3 Utilizando um anti-soro gerado contra a porção C-terminal da trialisina recombinante (fragmento não-lítico), identificamos a pró-trialisina em extratos de glândulas salivares contendo APMSF, inibidor da ativação da trialisina. O precursor apresentou menor atividade lítica contra tripomastigotas. Embora fosse previsto que o precursor teria uma porção pró de 33 resíduos, a diferença entre as bandas em SDS-PAGE da pró-trialisina e trialisina foi de cerca de 10-15 aminoácidos. Um peptídeo de fluorescência apagada contendo 12 resíduos da porção pró e 27 do N-terminal da trialisina madura foi sintetizado e observamos que sua atividade lítica era aumentada quando a serino-protease salivar triapsina ou endoproteinase Arg-C eram adicionadas, ao mesmo tempo em que o peptídeo alterava sua estrutura, indicando que a porção acídica é responsável pela inibição da lise. Esses resultados permitiram caracterizar o papel do N-terminal da trialisina no processo de lise, identificar o precursor da trialisina na glândula salivar, verificar sua ativação durante a salivação e melhor elaborar um mecanismo pelo qual a atividade é controlada durante o armazenamento da proteína nas glândulas salivares.