Papel dos glicosaminoglicanos da família da heparina na indução e estabilização de fibras β-amilóides derivadas da enzima proteolítica HTRA1 - Braga, Luiz Fernando Patekoski [UNIFESP] (2023)
[Introdução] A serinoprotease HTRA1 é um homotrímero formada por três cadeias polipeptídicas idênticas, essa enzima é capaz de degradar várias proteínas da matriz extracelular, tais como a fibronectina, os proteoglicanos agrecam, decorim, fibromodulina, bem como, regular a disponibilidade dos fatores de crescimento da família dos FGF, IGF e TGF-β, para a sinalização celular. Essa protease está envolvida em várias neuropatias, como na degeneração macular associada a idade (ARMD7), na distrofia corneana, em neuropatias hereditárias cerebrovasculares (CARASIL e CADASIL) e Alzheimer. Dentre os diversos glicosaminoglicanos (GAGs), a heparina é um potente indutor da formação de fibras β-amilóides em várias proteínas [Objetivos]. Os principais objetivos deste trabalho foram trabalho verificar a capacidade da enzima HTRA1 de se polimerizar e fibras β-amilóides, bem como, a capacidade dos GAGs, em especial da heparina, de interagir com a enzima HTRA1 e promover a indução e a estabilização aa polimerização da enzima HTRA1 recombinante. [Métodos] dessa forma, clonamos e expressamos em E. coli três isoformas recombinantes da enzima HTRA1: a enzima selvagem, a enzima inativa, mutante de sítio ativo S328A e a enzima defectiva do domínio PDZ (ΔPDZ). Verificamos por diferentes técnicas biofísicas e bioquímicas o impacto da interação molecular da heparina e de outros GAGs na estrutura tridimensional e na atividade catalítica da enzima HTRA1. A atividade catalítica das formas recombinantes da enzima HTRA1 foram monitoradas por espectrofluorimetria com o auxílio do substrato fluorescente do tipo FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), MCA-IRRVSYSF(K-Dnp)K. A polimerização dos monômeros da enzima HTRA1, bem como, a polimerização induzida por GAGs foi monitorada por DLS (Dynamic Light Scattering), SDS-PAGE, espectrofluorimetria, espectrometria de massa, coloração com Congo Red e por microscopia eletrônica de varredura. [Resultados] A heparina se mostrou um potente inibidor da atividade proteolítica da HTRA1, a heparina interage com maior afinidade na enzima livre (Ki = 85 ± 9 nM) do que no complexo enzima-substrato (αKi = 246 ± 34 nM); porém a ligação da heparina na enzima livre impede a ligação do substrato no sítio ativo. Esses resultados indicam que a heparina é um inibidor do tipo misto. Os nossos resultados também mostraram que o domínio PDZ controla alostericamente a ligação da heparina. A heparina interage tanto com o domínio catalítico da enzima HTRA1, bem como com seu domínio PDZ. A interação da heparina com o domínio PDZ da HTRA1 é capaz de estabilizar a forma homotrimérica da enzima, além de induzir a sua polimerização e a formação de fibras β-amilóides nessa proteína. Também foi observado por espectroscopia de CD e por espectrofluorimetria intrínseca que a heparina é capaz de promover alterações conformacionais na enzima HTRA1, induzindo tanto a formação de estruturas β-antiparalelas quanto a formação de fibras β-amilóides. Dentre os diversos GAGs estudados, nominalmente: heparina, condroitim-4 e 6-sulfato, dermatam-sulfato e ácido hialurônico, somente a o ácido hialurônico não foi capaz de induzir a formação de agregados amiloidogênicos na enzima HTRA1, essa indução é dependente da organização espacial das cargas negativas dos grupamentos sulfatos e carboxílicos desses polissacarídeos. A capacidade de indução dos agregados amilóides pela heparina é dependente do domínio PDZ da enzima, bem como, não depende da capacidade proteolítica da HTRA1, nem da capacidade inibitória da heparina. Observamos, também, que a formação de agregados proteicos da HTRA1 é dependente da força iônica do meio (≤ 160 mM) e da concentração da HTRA1 em solução. A enzima HTRA1 se autopolimeriza em concentrações ≥ 2.0 µM (pH 7.4) em força iônica = 0,15 M. Os dados obtidos por Microscopia Eletrônica de Varredura mostraram que a heparina induz a formação de estruturas fibrilares a partir de agregados esferoides de 40 nm. Os ensaios de espectroscopia UV-Vis da interação da HTRA1 com o corante Congo Red mostraram que os agregados de HTRA1 observados pela técnica de DLS são, de fato, fibras β-amilóides. [Conclusão]. A heparina é um potente inibidor da atividade proteolítica da HTRA1 (KI = 85 ± 9 nM). A HTRA1 é capaz de autopolimeriza, espontaneamente, formando fibras β-amilóides, em concentrações ≥ 2 µM em pH e força iônica fisiológicos. Os GAGs da família da heparina induzem e estabilizam essa polimerização. Esses resultados podem ser translacionados para as doenças neurológicas hereditárias ou adquiridas onde a enzima HTRA1 está sabidamente envolvida, na degeneração macular associada a idade (ARMD7), na distrofia corneana, em neuropatias hereditárias cerebrovasculares (CARASIL e CADASIL) e Alzheimer.