Estudo da imobilização da enzima fenilalanina desidrogenase em filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett de ácido esteárico e sua possível aplicação na detecção do aminoácido fenilalanina - Silva, Rafael Leonardo Cruz Gomes da [UNIFESP] (2020)
O presente trabalho descreve o estudo da atividade superficial da enzima fenilalanina desidrogenase (PDH), pura e na presença do surfactante ácido esteárico (HSt), como filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB). Para isso, empregamos técnicas de análise físico-química que permitiram avaliar a formação, morfologia, estruturação molecular, e estabilidade termodinâmica dos filmes produzidos. Estudos iniciais da atividade de superfície da PDH em água indicaram a presença de processos de adsorção/dessorção dinâmicos característicos de monocamadas interfaciais de materiais solúveis (monocamadas de Gibbs). O aumento da força iônica na subfase aquosa possibilitou a adsorção da enzima na interface, produzindo monocamadas de Langmuir estáveis. Os filmes formados na interface líquida foram transferidos para suportes sólido usando a técnica de LB com razões de transferência próximas à unidade em pressões de superfície de 30 mN/m. Espectroscopias na região do Infravermelho e por dicroísmo circular (DC) indicaram a presença majoritária de estruturas em α-hélice paralelamente orientadas ao plano da superfície do suporte sólido. O filme de PDH apresentou alta rugosidade relativa e espessura média de 8 nm, conforme revelado por microscopia de força atômica (AFM). A enzima se inseriu regularmente em monocamadas do surfactante HSt, produzindo filmes de Langmuir mistos, interagindo com sinergia positiva, elevada pressão de exclusão de 25,3 mN/m e estabilidade termodinâmica suficiente para permitir a posterior transferência a suportes sólidos. Os filmes mistos PDH-HSt foram transferidos com sucesso para suportes sólidos de quartzo com taxas de transferência próximas à unidade, formando filmes LB com arquitetura do tipo Y com um máximo de 15 camadas. O crescimento do filme foi acompanhado através de técnicas espectroscópicas (fluorescência e DC) e de microscopia (AFM), apresentando sinais de intensidade diretamente de fluorescência proporcionais ao número de monocamadas transferidas. Observou-se também que interações hidrofóbicas entre a enzima e os grupos apolares do ácido carboxílico produziram alterações conformacionais na estrutura secundária da PDH, evidenciado pelo surgimento de bandas espectrais (infravermelho e DC) do tipo β-folha. A capacidade do filme em detectar o aminoácido L-fenilalanina a uma concentração fixa de 2,5 mM foi testada em tampão glicina (pH 10,4) por meio da técnica de espectroscopia no UV-vis, apresentando uma atividade de 7,2x10-4 min-1 para o filme LB com 15 camadas. Assim, foi possível verificar, como prova de conceito, que a produção de filmes de Langmuir estáveis da enzima PDH na presença de ácido esteárico podem ser utilizados na construção de filmes Langmuir-Blodgett capazes de detectar o aminoácido L-fenilalanina.