Desenvolvimento dos Gonócitos e Espermatogônias Tronco em Ratos: Proliferação, Distribuição e Morte Revisitadas - Zogbi, Camila [UNIFESP] (2011)
As espermatogônias tronco são células responsáveis pela produção contínua dos gametas masculinos, os espermatozóides. Essas células se diferenciam a partir dos gonócitos, porém, pouco se sabe sobre sua biologia e sobre os processos pelos quais elas se diferenciam. Embora sejam células de grande importância, não há informações precisas sobre a dinâmica de formação dessas células a partir dos gonócitos nem sobre o número total e a distribuição das espermatogônias indiferenciadas nos testículos, o que dificulta a interpretação de estudos nessa área. A proposta deste trabalho foi analisar a proliferação, morte e distribuição dos gonócitos e pré-espermatogônias nos testículos de ratos no desenvolvimento embrionário e pós-natal, em períodos críticos do desenvolvimento testicular. Foram utilizados ratos com idades de 19dpc, 1, 3, 5, 8, 11 e 15dpp, cujos testículos foram analisados quanto à distribuição, proliferação e apoptose dos gonócitos e pré-espermatogônias durante o desenvolvimento testicular. A análise morfológica dos testículos, o método de TUNEL, a imunomarcação das proteínas p53 e caspase-3 clivada foram empregados para investigação de apoptose, enquanto a densidade numérica (Nv), quantificação de gonócitos, densidade de comprimento cordonal (Lv), comprimento cordonal total (L), volume total dos cordões seminíferos e estimativa do número total de gonócitos foram utilizados para investigação da distribuição dessas células. A citometria de fluxo foi empregada para avaliar a proliferação dos gonócitos através do uso do kit Guava Cell Cycle. Para identificar as espermatogônias indiferenciadas nas idades de 11 e 15dpc foi utilizada a imunomarcação da proteína OCT4. Durante a análise morfológica testicular observou-se que ocorre redução do número de gonócitos por seção testicular nos primeiros cinco dias após o nascimento e que as primeiras espermatogônias são observadas aos 8dpp. Foi observado aumento da Lv nos animais de 1dpp em relação aos de 19dpc. Dos 3 aos 11dpp, houve aumento progressivo da Lv, que voltou a diminuir aos 15dpp. Houve crescimento muito acentuado dos cordões seminíferos entre 19dpc e 1dpp. Após o nascimento, o crescimento continuou até os 15dpp, mas foi menos intenso. Já a Nv de gonócitos foi inversamente proporcional ao crescimento testicular, enquanto o número estimado de gonócitos foi cerca de quatro vezes maior aos 1dpp em relação aos de 19dpc. Isto explica os dados obtidos a partir da análise morfológica na qual a frequência de gonócitos por seção testicular diminuiu nos cinco primeiros dias após o nascimento. Após o nascimento, o número de gonócitos permaneceu estável até os 5dpp, sugerindo que não há morte ou proliferação dessas células nessas idades. Não foram detectados gonócitos em apoptose nas idades estudadas, embora corpos apoptóticos tenham sido observados. Esses corpos apoptóticos eram muito raros dos 19dpc aos 5dpp e começaram a se tornar mais frequentes aos 8dpp, atingindo sua frequência máxima aos 15dpp. Também aos 15dpp, células positivas para TUNEL e caspase 3 clivada foram observadas, mas essas células não puderam ser identificadas devido ao fato de sua morfologia já estar consideravelmente alterada. Contudo, todos os gonócitos de 19dpc até 8dpp foram positivos ao emprego da caspase-3 clivada, embora apresentassem morfologia normal. Isto indica que a caspase-3 clivada pode ter outra função, que não seja apoptótica, no desenvolvimento dos gonócitos. A análise ao citômetro de fluxo nas idades de 19dpc a 5dpp mostrou que mais da metade dos gonócitos encontravam-se em fase G0/G1 do ciclo celular, indicando que muitas estão em quiescência nestas idades. Não houve marcação da proteína OCT4 nas espermatogônias, o que impossibilitou a quantificação dessas células nas idades de 8, 11 e 15dpp. Os dados do presente estudo sugerem que a diminuição da frequência de gonócitos por seção testicular nos primeiros dias após o nascimento não é consequência de apoptose dessas células, como tem sido sugerido na literatura, mas sim de sua redistribuição ao longo dos cordões seminíferos. Como não há indícios de que estas células estejam proliferando nessas idades, menos gonócitos são observados por seção testicular. Concluiu-se ainda que a proteína OCT4 não está presente nos testículos de rato nas idades pós-natais, diferentemente do observado em camundongo. Estudos estão sendo realizados para verificar quando os gonócitos retomam a proliferação, quando a população definitiva de espermatogônias tronco é formada e quais seriam os marcadores ideais para estudos das espermatogônias indiferenciadas no rato.