Papel das vesículas extracelulares no transporte de fatores de virulência em Paracoccidioides brasiliensis. Utilização do modelo Pb18 - variantes virulenta e atenuada. - Octaviano, Carla Elizabete [UNIFESP] (2022)
Vesículas extracelulares (EVs) são componentes celulares arredondados delimitados por uma membrana de bicamada lipídico/proteica. Elas transportam para o ambiente extracelular, incluindo a parede celular, uma variedade de moléculas que potencialmente promovem sinalização à distância entre patógeno-hospedeiro e entre microrganismos. Sua importância na comunicação célula-célula, no remodelamento da parede celular e na virulência fúngica está começando a ser melhor explorada. A paracoccidioidomicose (PMC) é uma micose sistêmica de natureza granulomatosa crônica prevalente em áreas endêmicas na América Latina e é causada por espécies do fungo dimórfico dependente de temperatura Paracoccidioides spp. Nosso grupo e seus colaboradores têm se dedicado à caracterização de EVs deste e de outros fungos patogênicos. No presente trabalho, estudamos o efeito das EVs fúngicas utilizando o modelo do isolado Pb18 virulento/atenuado de P. brasiliensis. O modelo consiste em variantes que exibem transitoriamente maior (vPb18) ou menor (aPb18) patogenicidade, sendo que a virulência pode ser restabelecida por passagem em camundongos. Neste trabalho, a incubação de aPb18 com vEVs, isoladas de vPb18, foi capaz de reverter a sensibilidade de aPb18 ao estresse oxidativo e nitrosativo aos níveis apresentados por vPb18. Isso provavelmente ocorreu devido à expressão de moléculas antioxidantes, visto que houve aumento da expressão dos genes da oxidase alternativa AOX e das peroxirredoxinas HYR1 e PRX1, além de uma maior atividade de catalase. In vitro, aEVs (isoladas de aPb18) induziram uma produção significativamente maior de mediadores de inflamação, especificamente, óxido nítrico, TNF-α, IL-6 e MCP-1, quando co-incubadas com macrófagos da linhagem Raw 264.7 e macrófagos derivados da medula óssea, sendo que o efeito foi dose-dependente. In vivo, o tratamento subcutâneo com EVs (três doses, com intervalo de 7 dias entre as doses) antes do desafio com vPb18 exacerbou a PCM murina, conforme observado pelo maior número de unidades formadoras de colônias nos pulmões após 30 dias de infecção e pela análise histopatológica do tecido. Esse efeito foi mais pronunciado em camundongos tratados com aEVs, provavelmente porque as concentrações pulmonares de TNF- α, IFN-γ, IL-6 e MCP-1 estavam especialmente aumentadas nesses animais e evocaram uma resposta possivelmente hiperinflamatória. Nossos estudos foram realizados com EVs obtidas por ultracentrifugação diferencial de leveduras de ambas as variantes do isolado Pb18 cultivadas em meio definido Ham’s F-12 agar acrescido de 0,5% de glicose. Nessas condições, vEVs e aEVs apresentaram tamanhos semelhantes, mas provavelmente carregam conteúdos distintos, considerando que as vEVs tendem a agregar após armazenamento a 4°C e -20°C. Além disso, o conteúdo de proteína e ergosterol estavam significativamente dimunuídos em aEVs. Em conjunto, nossos resultados sugerem que EVs derivadas de vPb18 podem induzir em células receptoras aPb18 a expressão de traços de virulência característicos da variante virulenta. Os resultados apresentados nesta dissertação são originais e trazem uma contribuição importante para o entendimento sobre o papel das EVs fúngicas na comunicação célula-célula e sobre seu efeito na patogênese da PCM murina. Em nosso trabalho, esse efeito foi negativo, mas depende claramente das condições experimentais, uma vez que as EVs são estruturas complexas e dinâmicas.