Estabelecimento de um modelo celular para o screening de peptídeos relacionados a liberação de DNA mitocondrial e a ativação de vias inflamatórias - Rocha, Ana Paula da [UNIFESP] (2021)
Introdução: Estudos preliminares demonstraram que peptídeos desenhados a partir de sequências de aminoácidos de proteínas purficadas a partir extrato bruto das cerdas da lagarta L.obliqua e de proteínas recombinantes obtidas através de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma sculptun são capazes de desencadear citoproteção. O processo autofágico mitocondrial pode ser considerado um mecanismo citoprotetor e anti-inflamatório, pois além de favorecer a degradação das organelas disfuncionais, induz alterações morfológicas que minimizam o escape de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de DNA mitocondrial (mtDNA) para o citoplasma. Os macrófagos desempenham um papel central durante o processo inflamatório, portanto, eles foram escolhidos como tipo celular para o estabelecimento de uma plataforma de screening usando potencias peptídeos com funções biológicas. Objetivos: O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a participação de peptídeos com atividade anti-inflamatória no processo de autofagia de macrófagos derivados de THP-1, através da caracterização de novas vias que levem a liberação de mtDNA e a ativação de vias inflamatórias. Métodos: O desenho e escolha dos peptídeos mais promissores foi baseado em estudos prévios do grupo. Inicialmente, a padronização do modelo celular para o screening foi definida através do perfil de translocação do fator de transcrição NF-Kb utilizando a ferramenta de High-Content Screening (HCS), em condições de privação de soro fetal bovino (1 % de SFB). Essa metodologia nos permitiu o delineamento de forma semi-automatizada e customizada de todas as padronizações e experimentos subsequentes, como por exemplo, avaliação da liberação de TNFα por multiplex; caracterização da morfologia de redes mitocondriais através de microscopia confocal de varredura utilizando sondas específicas; definição das condições de cultivo celular para a liberação de mtDNA através de PCR em tempo real; e finalmente, o estudo da ativação da via do inflamassoma NLRP3. Todos estes ensaios foram determinantes para a validação do modelo celular. Resultados: Durante restrição calórica (1% SFB), observou-se redução significativa na translocação de NF-kB, um parâmetro clássico para o estudo de autofagia. Por microscopia confocal, verificou-se um aumento significativo das redes mitocondriais frente ao tratamento com os peptídeos e sob restrição nutricional. Observou-se também uma redução da liberação de mtDNA para o meio extracelular durante a privação de soro e sob o estímulo com os peptídeos estudados. Ainda, verificamos uma redução da expressão da proteína NLRP3, também durante a indução de autofagia e principalmente sob tratamento com o peptídeo denominado L3. Conclusão: Diante dos resultados obtidos, pode-se sugerir que foi implementado um modelo celular o screening de moléculas de interesse farmacológico que permite estudar moléculas responsivas em condições inflamatórias e autofágicas.