Estudos de síntese, conformação e atividade biológica da gomesina e análogos através de diferentes metodologias - Domingues, Tatiana Moreira [UNIFESP] (2013)
O peptideo antimicrobiano gomesina (Gm) foi inicialmente isolado da hemolinfa da Acanthoscurria gomesiana, uma aranha caranguejeira encontrada no Brasil. Fortemente cationico, possui 18 residuos de aminoacidos (pGlu1-Cys-Arg-Arg-Leu5-Cys-Tyr-Lys-Gln-Arg10-Cys-Val-Thr-Tyr-Cys15-Arg-Gly-Arg-NH2) e duas ligacoes de dissulfeto nas posicoes Cys2,15 e Cys6,11. Trata-se de um PAM de largo espectro de acao, cuja atividade litica foi avaliada como elevada e rapida. Gm e analogos foram sintetizados pelo metodo em fase solida e utilizando-se a estrategia t-Boc. Em seguida, os peptideos foram clivados, purificados e caracterizados, alcancando-se um indice de pureza satisfatorio. Por meio de ensaios biologicos (de atividade antimicrobiana e hemolitica), estudos espectroscopicos e de cinetica de vazamento de carboxifluoresceina (CF), a Gm e todos os seus analogos foram avaliados, tendo sido possivel tracar uma relacao estrutura/atividade para esses peptideos, que comprova a importancia da manutencao das ligacoes de dissulfeto pelos analogos da Gm para o desempenho de uma boa atividade litica. Com base nesses primeiros resultados, a Gm e seu analogo menos ativo ([Ser2,6,11,15]-Gm) foram selecionados para analises mais detalhadas, utilizando-se, para tanto, modelos de membrana. Assim sendo, bicamadas lipidicas (LUVs), micelas e monomeros de SDS (dodecil sulfato de sodio) foram os sistemas mimeticos escolhidos para investigar o mecanismo de acao desses peptideos. A analise dos dados de calorimetria de titulacao isotermica (ITC) e de cinetica de vazamento de CF indicou forte interacao da Gm com as LUVs e rapida acao de desestruturacao dessas bicamadas, em um processo entalpicamente dirigido. Atraves da utilizacao das tecnicas de espalhamento de luz estatico e dinamico, e microscopia otica de contraste de fase, foi possivel detectar a formacao de grandes agregados lipidicos, mesmo em baixas razoes peptideo/lipidio. Com o intuito de minimizar a agregacao lipidica, um lipidio modificado contendo o polimero polietilenoglicol (PE-PEG2000) foi adicionado as vesiculas. A Gm tambem apresentou intensa ligacao exotermica (ITC) e uma alta taxa de permeabilizacao dessas bicamadas modificadas, alem de reduzida formacao de agregados. O analogo [Ser2,6,11,15]-Gm exibiu semelhante atividade a da Gm em interacao com LUVs contendo 50 mol% de POPG e uma diminuicao acentuada dessa atividade para LUVs com 25 mol% de POPG, reafirmando a importancia da atracao eletrostatica para esses peptideos. Alem disso, espectros de CD confirmaram que a Gm e seu analogo linear adotam conformacao em dobra beta quando em contato com lipossomas e SDS acima e abaixo da CMC (concentracao micelar critica). Em outros estudos, analises de fluorescencia e absorbancia de analogos ciclicos da Gm, marcados com um residuo de Trp, em presenca de diferentes concentracoes de SDS, apontaram para uma maior interacao desses peptideos com o SDS monomerico, resultando em um maior blueshift do espectro de emissao do Trp, bem como em um aumento na absorbancia das amostras, maior ou igual ao causado pelo SDS na forma micelar. O uso de dois sistemas mimeticos de membrana diferentes, bem como as diversas metodologias empregadas, foi fundamental para uma ampla investigacao das etapas requeridas pela Gm para causar a ruptura das biomembranas. Alem disso, esses estudos foram importantes na deteccao e caracterizacao da formacao de agregados durante a interacao da Gm com moleculas anfifilicas anionicas, agregacao essa que possivelmente se estende a outros peptideos cationicos, e que muitas vezes e negligenciada.