Caracterização da diversidade genotípica de cepas de Candida parapsilosis isoladas de hemoculturas - Amorim, Cledja Soares de [UNIFESP] (2007)
Introdução: A heterogeneidade genética de Candida parapsilosis tem sido reportada com emprego de distintos métodos moleculares, identificando claramente três grupos (grupos I, II e III). Recentemente, a análise filogenética baseada no polimorfismo de alguns genes propôs uma reclassificação de C. parapsilosis grupo II e III em espécies distintas: Candida orthopsilosis e Candida metapsilosis, respectivamente. Ainda há poucos estudos epidemiológicos avaliando a prevalência e relevância clínica dessas espécies. Métodos moleculares têm sido empregados para discriminar esses três grupos e também para tipagem intra-específica dessas novas espécies. Entretanto, isolados de C. parapsilosis não têm demonstrado grande diversidade genotípica por estes métodos. É necessário o desenvolvimento de técnicas moleculares de baixo custo para viabilizar a identificação dessas espécies em laboratório de rotina. Objetivos: 1) selecionar oligonucleotídeos para utilização em RAPD que apresentem poder discriminatório para identificação de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. 2) avaliar a prevalência dessas três espécies em amostras de hemoculturas coletadas em hospitais da América Latina. 3) analisar a diversidade genotípica entre isolados de C. parapsilosis oriundos de diferentes áreas geográficas. Material e métodos: Para este estudo, foram selecionadas todas as amostras de hemoculturas identificadas fenotipicamente como C. parapsilosis, catalogadas no Banco de Microrganismos do Laboratório Especial de Micologia da UNIFESP, que foram coletadas durante o período de 2003 a 2005, incluindo as cepas de referência destas três espécies. Após identificação fenotípica, através do sistema de ID32C e microcultivo, as colônias sugestivas de C. parapsilosis foram submetidas ao método RAPD para identificação de espécie. Para interpretação dos resultados, os perfis genotípicos gerados pelo RAPD foram submetidos à análise por dendrograma utilizando o programa GEL COMPAR II versão 4.5. Todas as amostras identificadas como C. orthopsilosis e C. metapsilosis neste estudo foram submetidas ao seqüenciamento da região ITS para confirmação da identificação de espécie. Resultados: Inicialmente, foram estudados 7 oligonucleotídeos para serem utilizados em RAPD que tivessem reprodutibilidade e poder discriminatório em amostras de origem epidemiologicamente conhecida. Desses, o iniciador 1281 apresentou melhor performance, portanto foi o escolhido para realização neste estudo. Do total das 166 amostras estudadas, 148 (89%) eram C. parapsilosis, 13 (8%) C. orthopsilosis e 5 (3%) foram identificadas como C. metapsilosis. A análise por dendrograma revelou que as cepas de C. orthopsilosis apresentaram maior heterogeneidade genotípica entre si. Cepas de C. parapsilosis foram geneticamente mais semelhantes entre si (Sab 80%) e formaram 6 subgrupos com uma similaridade superior a 90%. Estes subgrupos eram constituídos, em sua maioria, por cepas de mesma localidade geográfica demonstrando serem mais relacionadas entre si. As análises dos isolados oriundos do estado e da cidade de São Paulo demonstraram uma maior consistência do método, mostrando maior similaridade genética entre cepas de cidades vizinhas e de mesmo centro médico, revelando disseminação de cepas de mesma origem clonal que sofreram microevoluções nestes centros médicos. Conclusões: O RAPD, com o emprego do iniciador 1281 demonstrou ser uma ferramenta de grande utilidade na identificação das espécies do complexo C. parapsilosis. C. parapsilosis foi a espécie de maior prevalência entre as amostras de hemocultura estudadas, seguida de C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Quanto à análise genotípica intra-específica, C. orthopsilosis foi a espécie mais heterogênea do grupo. C. parapsilosis foi a espécie mais homogênea geneticamente, provavelmente devido à sua maior adaptação ao homem. Cepas dessa espécie podem tornar-se persistentes em cada cidade ou por centros médicos.