Estudo da adesão de Escherichia coli enteroagregativa atípica a superfícies biótica e abiótica - Monfardini, Mariane Vedovatti [UNIFESP] (2017)
Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente associado à doença diarreica, que apresenta como característica o padrão de adesão agregativa (AA) a superfície de células HEp-2 ou Hela. Nas amostras de EAEC típicas, o fenótipo AA é mediado por adesinas fimbriais AAFs ("Aggregative Adherence Fimbriae"), codificadas em plasmídios denominados pAA. As AAFs são reguladas por um ativador de transcrição da família AraC/XyIS denominado AggR. Recentemente foi proposta a classificação de amostras de EAEC nos grupos típica e atípica, levando em consideração a presença ou ausência do regulon aggR, respectivamente. Este estudo teve como objetivo avaliar as propriedades de aderência em células HeLa e em superfície de poliestireno de 32 amostras de EAEC atípicas isoladas de crianças com diarréia (N = 9) e sem diarréia (N = 23) e provenientes de crianças quilombolas no norte do Espírito Santo. Adicionalmente, buscou-se identificar novo(s) fator(s) de aderência envolvido(s) no fenótipo AA das EAEC atípicas. Das 32 amostras estudadas, 8 amostras apresentaram o padrão AAt (AAt típico), com a presença de agregados bacterianos localizados na superfície celular e na lamínula semelhante a amostra protótipo EAEC 042, 14 amostras apresentaram o padrão AAa (AA atípico) com o predomínio de bactérias aderidas as células, e 10 amostras o padrão AAc, caracterizado pela presença de cordões de bactérias aderidas a superfície das células e lamínula. A formação de biofilme em superfície de poliestireno foi observada em 17 (53,1%) amostras. Os resultados de PCR mostraram que nenhuma das 32 amostras transportava as sequências relacionadas às adesinas Ap58, AAF/IV, AAF/V, e PT4 e Hra 1. A análise do conteúdo plasmidial mostrou a presença de um ou mais plasmídios em 15 das 32 amostras analisadas, com peso molecular entre 4,6 e 98 MDa. Não foi observado um único plasmídio em comum presente nas 15 amostras. Com o objetivo de identificar novos fatores envolvidos no fenótipo AA, as amostras Q010 (AAt), Q015 (AAa) e Q212 (AAc) foram submetidas a ensaios de mutagênese com transposon. Cerca de 960 clones de cada banco de mutantes foram testados quanto a adesão a células HEp-2, sendo identificados 33 mutantes não aderentes (13 da amostra Q010, 5 da amostra Q212 e 15 da amostra Q015). A análise da sequência do DNA flanqueado pela inserção do transposoma nos mutantes Q010-Tnp levou a identificação de xikimato quinase, treonina sintetase, glicosiltransferase, fosforibosilamina - glicina ligase, protease La dependente -ATP, fosfoenolpiruvato carboxilase, chaperonina DnaJ, fator de enlongação 4, regulador transcripcional (HU), aspartatoquinase / homoserina desidrogenase e transportador ABC-ligador de ATP. Os mutantes Q212-Tnp apresentaram identidade com arginina descarboxilase biossintética, proteína de estabilização do plasmídio, regulador transcripcional da família Fis e proteína Ftks de divisão celular. Seis mutantes Q015-Tnp apresentaram identidade com endoprotease serina/protease, arginina descarboxilase biosintética, NADH desidrogenase, helicase RNA dependente de ATP e ativação/secreção de hemolisina. Em outros seis mutantes, o Tnp foi inserido em locais diferentes de uma mesma ORF de 4,380 bp a qual codifica um filamento de hemaglutinina. Para análise comparativa, foi realizado o sequenciamento completo da ORF de 1.838 aminoácidos na amostra Q015, denominada ORFhema a qual continha 5.517 pb. O BLAST desta sequência revelou uma alta similaridade com a hemaglutinina da E. coli 7-233-03_S3_C2 (GenBank accession number. KEN34655), com identidade de 99% do aminoácido 1 ao 1.121 e 100% dos 225 últimos aminoácido; e na região entre os nucleotídeos 3.381 e 4.747, foram encontradas duas repetições com identidade de 76% do aminoácido 1.205 ao 1.303. Análise do sequenciamento da região flanqueadora da ORFhema identificou na posição "upstream" uma ORF de 603 aminoácidos, na mesma orientação, com homologia de 99% de identidade com a proteína de ativação/secreção de hemolisina da família ShlB/FhaC/HecB e 51% de identidade com a adesina Enf, e na posição "downstream" uma outra ORF de 623 aminoácidos a qual apresentou uma identidade de 72% com a glicosil transferase EtpC. Para verificar o papel desta ORFhema no fenótipo AA, foram construídas linhagens mutantes e complemento para análise comparativa com a linhagem selvagem. Nos ensaios de adesão a células HeLa e formação de biofilme, a linhagem mutante Q015 hema perdeu a capacidade de aderir e produziu menor quantidade de biofilme do que a linhagem selvagem, enquanto que o mutante complementado restaurou em parte a adesão e a formação de biofilme, quando comparado com a linhagem selvagem. Concluindo, os resultados obtidos em nosso trabalho mostraram que a maioria das amostras de EAEC atípica apresentou o padrão AA, sem a formação de agregados em células HeLa e em lamínula ("honeycomb"). Na caracterização dos genes envolvidos no fenótipo AA de EAEC atípica, foi identificada uma região a qual apresentou homologia com uma hemaglutinina, que parece desempenhar papel de adesina na amostra Q015.