Silenciamento gênico por miRNA do transportador OsAMT1.3 e seu efeito sobre a eficiência de absorção de amônio (Oryza sativa L.) - Neves, Marcela Jacques de Lemos (2014)
O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do silenciamento do gene do transportador OsAMT1.3 em arroz sobre a habilidade das plantas em absorver o N-NH4+ através do sistema de alta afinidade, bem como os reflexos sobre o metabolismo de nitrogênio. Para o silenciamento do gene OsAMT1.3 foi usada a tecnologia do miRNA artificial (amiRNA). Para tanto, a sequência codante do gene (cds) OsAMT1.3 é inserida no sistema WMD3 que indica sequências de amiRNA’s para silenciar o próprio OsAMT1.3. A inserção do amiRNA foi feita por PCR usando o vetor pNW55 como molde. O miRNA foi inserido no vetor IRS154 por corte e ligação usando a enzima T4 DNA ligase. O produto da ligação foi introduzido em E. coli por eletroporação. Após a transformação de arroz da variedade Nipponbare mediada por Agrobacterium. A seleção das plantas transformadas foi feita com o antibiótico Higromicina. No total foram obtidas 14 linhagens transformadas. Para confirmar que as plantas mutantes possuiam a construção, foi realizado o teste com a folha bandeira em solução de higromicina. Seis linhagens apresentaram boa produção de sementes e houve uma linhagem com crescimento anormal. Após a multiplicação das linhagens em casa de vegetação, foram selecionadas as linhagens L1, L2 e L6 para os experimentos de análise dos efeitos do silenciamento do gene OsAMT1.3. Primeiramente, as linhagens selecionadas foram avaliadas quanto ao nível de silenciamento do gene OsAMT1.3. As linhagens de arroz transformadas apresentaram maior nível de silenciamento do gene OsAMT1.3 quando comparadas às plantas controle, no entanto, diferentes níveis de silenciamento foram observados. A linhagem L1 apresentou menor nível de silenciamento do gene OsAMT1.3, enquanto L2 e L6 apresentaram maior silenciamento. As linhagens L1, L2 e L6 e a planta controle IRS (transformada com o vetor vazio) foram cultivadas em câmara de crescimento até os 30 dias após a germinação, com a aplicação dos seguintes tratamentos: sem N por três dias, ressuprimento com 0,15 mM de N-NH4+ após três dias de privação de N (baixa dose) e 2,0 mM de N-NH4+ constante (alta dose). As linhagens L1, L2 e L6 apresentaram menor absorção de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ quando comparadas com as plantas controle (IRS), enquanto as plantas cultivadas com 2,0 mM de N-NH4+ não apresentaram diferenças na absorção de NH4+. A expressão dos genes dos transportadores de NH4+ OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3 foi induzido pelo tratamento com 0,15 mM de N-NH4+ nas plantas controle (IRS), enquanto as linhagens transformadas apresentaram repressão dos genes OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3. A menor absorção de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ causou menor nível de N-NH4+ e N-amino nas raízes das linhagens transformadas, enquanto nas plantas com 2,0 mM de N-NH4+ houve pouca alteração nos conteúdos de N-NH4+ e N-amino. Os resultados indicam que o silenciamento do gene OsAMT1.3 provoca regulação negativa dos transportadores OsAMT1.1 e OsAMT1.2, alterando a absorção de NH4+. Apesar do gene OsAMT1.3 ser menos expresso que os genes OsAMT1.1 e OsAMT1.2, o transportador OsAMT1.3 pode estar envolvido na eficiência de absorção em baixas doses de NH4+.