Caracterização dos transportadores OsNTR1.1A, OsNTR1.1B e OsNTR1.1C por meio da reversão fenotípica do mutante chl1-5 de Arabidopsis thaliana - Chamba, Juan Sebastian Vera (2018)
A absorção de Nitrogênio (N) pelas plantas é uma etapa chave para a eficiência de uso de N, afetando a produção de massa fresca e rendimento de grãos. O transceptor NRT1.1 de Arabidopsis thaliana foi identificado como sinalizador da absorção de nitrato (NO3-). Em arroz, três prováveis ortólogos do transceptor NRT1.1 foram identificados, nomeados de OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C. O objetivo deste estudo foi avaliar se a superexpressão dos genes OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C em plantas mutantes chl1-5 de Arabidopsis thaliana (sem o gene NRT1.1) restabelecem a capacidade de transporte e sinalização pelo nitrato perdida no mutante nocauteado. O processo de transformação de plantas chl1-5 de A. thaliana foi mediante floral dip com as cepas de Agrobacterium tumefaciens da linhagem LBA4404 mediante as construções obtidas 35S:OsNRT1.1A:HA, 35S:OsNRT1.1B:HA, 35S:OsNRT1.1C:HA e 35S:OsNRT1.1sa:HA (promotor:gene:tag de HA). Posteriormente foi utilizado o antibiótico canamicina para obter as linhagens segregantes produto da transformação, sendo que apenas as plantas com duas cópias do gene foram selecionadas para testar os diferentes níveis de expressão gênica das plantas obtidas. Para verificar a resistência das plantas mutantes ao clorato (NaClO3), foi montado o experimento com plantas homozigotas, e suas sementes foram germinadas sobre substrato comercial e vermiculita, aos 23 dias após o plantio foram iniciadas aplicações com 12 mM de NaClO3. Para avaliar a expressão gênica alterada pela introdução de OsNRT1.1A, OsNRT1.1B ou OsNRT1.1C no mutante chl1-5, foram desenhados iniciadores para análise de expressão dos transportadores de NO3- de alta afinidade e baixa afinidade. Foram usadas duas linhagens de cada transformação nos experimentos, além de plantas tipo silvagem (WT) e plantas mutantes chl1-5. O teste com clorato mostrou a capacidade dos transportadores OsNRT1.1A, OsNRT1.1B ou OsNRT1.1C de absorver nitrato, evidenciado pelo decréscimo da massa fresca provocado pela redução do clorato a clorito pela nitrato redutase, produto tóxico para as células. A inserção do transportador OsNRT1.1B causou a maior redução de crescimento no teste do clorato em comparação com OsNRT1.1A e OsNRT1.1C, chegando aos mesmos níveis de redução do crescimento da planta tipo silvestre (WT). As análises de expressão mostraram que a inserção dos genes OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C em Arabidopsis thaliana chl1-5 foi capaz de induzir a expressão dos genes OsNRT2.1 e OsNAR2.1, sendo que a forma splicing alternativo de OsNRT1.1A (OsNRT1.1Asa) não afetou de maneira significativa a expressão de OsNRT2.1 e OsNAR2.1. Os resultados obtidos mostram a capacidade dos ortólogos de NRT1.1 em arroz (OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C) em absorver nitrato e sinalizar para a expressão de outros transportadores de nitrato (transceptor), podendo afetar a eficiência de absorção de nitrogênio.