Efeito da superexpressão dos fatores de transcrição ZmDof1 e OsDof25 sobre a eficiência de uso de nitrogênio em Arabidopsis thaliana L - Santos, Leandro Azevedo (2009)
Com o objetivo de aumentar a eficiência de uso de nitrogênio (EUN) em plantas, foi identificado e clonado o fator de transcrição OsDof25 de arroz, cujo provável ortólogo é o ZmDof1 de milho, já identificado e parcialmente caracterizado. Também foi clonado o ZmDof1 para análises comparativas com o OsDof25, a fim de comprovar que este último é realmente ortólogo do ZmDof1. As construções para superexpressão destes fatores de transcrição em Arabidopis foram feitas utilizando o sistema gateway de clonagem para obtenção dos vetores de expressão 35S:ZmDof1:HA e 35S:OsDof25:HA. Foram obtidas linhagens com diferentes níveis de expressão destes genes, mas com apenas uma inserção. As linhagens transgênicas obtidas quando crescidas em meio MS ½ força iônica (10mM de NH4 + e 20mM de NO3 -) apresentaram fenótipos como clorose e dificuldade de desenvolvimento, ao passo que quando cultivadas em solo mostraram desenvolvimento vegetativo mais intenso e atraso para emissão da inflorescência. Quando analisadas as modificações de expressão gênica causadas pela superexpressão destes fatores de transcrição, observou-se que ambos os fatores de transcrição provocaram aumento de expressão dos transportadores de amônio de alta e baixa afinidades (AMT1.1 e AMT2.1 respectivamente), indicando que o fenótipo observado pode ser devido ao efeito tóxico do excesso de amônio absorvido. Verificou-se também aumento de expressão das enzimas piruvato quinase (PK1 e PK2) e fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC1 e PEPC2). A piruvato quinase converte o fosfoenolpurato (PEP) a piruvato, enquanto a fosfoenolpiruvato carboxilase converte o PEP a oxalacetato (OAA) que pode sofrer ação da malato desidrogenase originando o malato. Ambos os metabólitos, piruvato e malato, alimentam o ciclo de Krebs. Houve também aumento de expressão da isocitrato desidrogenase, enzima presente na mitocôndria (ciclo de Krebs) e no citosol que converte isocitrato a 2-oxoglutarato (2-OG). Assim, é provável que o aumento da expressão destas enzimas do metabolismo de carbono foi necessário para aumentar a produção de 2-OG e, por conseguinte, diminuir o efeito tóxico do excesso de amônio absorvido. Além disso, observou-se aumento de expressão e atividade da glutamato desidrogenase (GDH). Essa enzima pode atuar tanto na direção da aminação, quanto na direção da desaminação, em condições de excesso de amônio e/ou sob condições de limitação de carbono nas plantas, respectivamente.