Caracterização do gene 18S rRNA em parasitos do grupo Apicomplexa: uma abordagem aplicada à seleção de marcadores moleculares - Pinheiro, Sthephanie Nassif (2018)
O grupo Apicomplexa compreende protozoários causadores de deonças mundialmente distribuídas como malária, toxoplasmose ou distúrbios intestinais oportunistas. Ainda nos dias de hoje, os principais protozoários de importância médica geralmente são identificados por microscopia óptica, o que dificulta a classificação precisa e o diagnóstico dos pacientes principalmente nos casos em que a parasitemia é baixa. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver um método molecular alternativo que possibilite a identificação de ampla variedade de protozoários do grupo Apicomplexa. Foi desenvolvido um sistema de primers para utilização em uma reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) em duas etapas (semi-nested PCR). O alvo investigado para o desenho de primers foi o gene 18S rRNA, por ser um alvo amplamente utilizado para screening e identificação de espécies em estudos de biodiversidade. A partir da análise da sequência e caracterização de potencial formação de estruturas secundárias, foram desenhados conjuntos de primers que se anelam em regiões conservadas e flanqueiam regiões variáveis no gene. A eficiência de cada conjunto de primers foi avaliada por PCR in silico. Foi selecionado um conjunto de primers que, quando usado de forma aninhada, pode gerar ~166 amplicons com sequências distintas, que podem ser usados para discriminar gêneros e espécies de Apicomplexa por diferença no tamanho em gel de agarose e por sequenciamento. O método proposto foi validado in vitro e sua eficiência na identificação de algumas espécies de protozoários de interesse médico foi confirmada. Após etapas adicionais de validação, esse método poderá ser utilizado para triagem inicial em casos de suspeita de es e também para determinação de diferentes espécies de parasitos.