Aplicação dos íntrons do grupo I do mitogenoma de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii para identificação de espécies e sua associação com susceptibilidade a antifúngicos - Gomes, Ronald Muryellison Oliveira da Silva (2023)
Os complexos de espécies de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são compostos por fungos patogênicos que matam mais de 112.000 pessoas anualmente em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o principal sintoma da criptococose. Características como virulência e susceptibilidade a antifúngicos podem variar dentro de cada espécie segundo o genótipo fúngico: C. neoformans é dividido nos tipos moleculares VNI, VNII, VNIII e VNIV e C. gattii em VGI, VGII, VGIII e VGIV. Sendo assim, é necessário e urgente um diagnóstico diferencial com marcadores moleculares específicos. Os íntrons autocatalíticos do grupo I podem ser um alvo potencial para distinção entre os tipos moleculares dessas leveduras já que possuem polimorfismos quanto a sua presença e sequência de pares de bases. Além disso, como o auto-splicing destes elementos é vital para a célula fúngica, eles são considerados importantes alvos terapêuticos, uma vez que estão ausentes no genoma humano. Com base nisso, este estudo objetivou avaliar a presença de íntrons do grupo I nos genes mitocondriais cob e cox1 de isolados fúngicos do gênero Cryptococcus, buscar ORFs com genes de endonucleases nas sequências intrônicas, averiguar o potencial uso desses elementos genéticos como marcadores moleculares para diferenciação de genótipos e/ou espécies e analisar sua relação com a susceptibilidade a antifúngicos, além de estudar sua origem, distribuição e evolução através de análises filogenéticas. Os dados obtidos da amplificação de íntrons dos genes cob e cox1 mostraram que o complexo C. neoformans possui em média menos íntrons em seu mitogenoma e que há um grande polimorfismo de presença e de tamanho destes elementos entre e dentro dos genótipos, o que impossibilita o uso de um único marcador intrônico para diferenciar genótipo e/ou espécie nos complexos C. neoformans e C. gattii. Contudo, a diferenciação entre as espécies é possível com combinações de PCRs dos íntrons de mtLSU e cox1 para espécies de C. neoformans e dos íntrons de mtLSU e cob para C. gattii. Aproximadamente 80,5% dos íntrons sequenciados possuíam homing endonucleases e as análises filogenéticas mostraram que íntrons que ocupam o mesmo sítio de inserção formam clados monofiléticos e provavelmente possuem como ancestral comum um íntron que invadiu esse sítio antes da divergência entre as espécies. Houve apenas um caso de invasão heteróloga oriunda provavelmente de transferência horizontal entre um isolado do genótipo VGIV e outros fungos. Quanto aos ensaios de susceptibilidade aos antifúngicos, viu-se que os valores de concentração inibitória mínima do fluconazol, 5-flucitosina e pentamidina se mostraram estatisticamente associados aos complexos de espécies, tendo o C. gattii maiores MICs para o fluconazol e o C. neoformans maiores MICs para 5-flucitosina e pentamidina. A presença de íntrons se mostrou relacionada com a susceptibilidade à anfotericina-B, para a qual uma maior quantidade de íntrons esteve associada a menores valores de MIC e à 5-flucitosina e pentamidina, para as quais a influência da presença de íntrons variou entre os complexos: quanto à 5-flucitosina, a presença de íntrons se relacionou com menor susceptibilidade em C. neoformans e maior em C. gattii, e o cenário oposto foi visto para pentamidina, para a qual os íntrons estiveram associados à maior susceptibilidade em C. neoformans e menor em C. gattii.