Recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli e remoção de endotoxina utilizando adsorção em leito expandido - Sousa Júnior, Francisco Canindé de (2015)
O crescente interesse e aplicações dos produtos biotecnológicos vêm aumentando o desenvolvimento de novos processos de recuperação e purificação de proteínas. A adsorção em leito expandido (ALE) tem se destacado como uma técnica promissora para essa finalidade, pois combina em uma única operação as etapas de clarificação, concentração e purificação da proteína alvo, reduzindo assim tempo e custos de operação. Neste contexto, o objetivo desta tese foi avaliar a recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 e a remoção de endotoxina por ALE. Na primeira etapa do trabalho foram realizados ensaios em taques agitados sob a forma de dois planejamentos experimentais, para definir as condições ótimas de adsorção e eluição do antígeno na resina Streamline chelating. Nos ensaios de adsorção usando o leito na forma expandida empregou-se uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba peristáltica. Na segunda etapa do trabalho, avaliou-se a remoção de endotoxina durante o processo de recuperação do antígeno, empregando o tensoativo nãoiônico triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Na terceira etapa, buscou-se elaborar um modelo matemático capaz de prever as curvas de ruptura do antígeno 503 em coluna na forma expandida. Os resultados do planejamento experimental para adsorção do antígeno 503 mostraram o pH 8,0 e a concentração de NaCl de 2,4 M como melhores condições de adsorção. No segundo planejamento, o único fator significativo para eluição foi a concentração de imidazol, definida em 600 mM. A isoterma de adsorção do antígeno 503 mostrou bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores de qmax (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados foram de 1,95 mg/g e 0,34 mg/mL, respectivamente. Através dos testes de purificação diretamente do homogeneizado não clarificado obteve-se uma recuperação de 59,2% da proteína de interesse e um fator de purificação de 6,0. A adição do tensoativo não-iônico Triton X-114 à etapa de lavagem da ALE proporcionou altos valores (>99%) de remoção do LPS inicialmente presente nas amostras para todas as condições estudadas. O modelo matemático obtido para descrever a curva de ruptura do antígeno 503 na resina Streamline Chelanting em leito expandido apresentou bom ajuste aos dados experimentais, tanto para etapa de estimativa de parâmetros quanto para de validação. O modelo validado foi utilizado na otimização das eficiências, obtendo-se os valores máximos de eficiência do processo e eficiência da coluna de 89,2% e 75,9%, respectivamente. Portanto, ALE mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação da proteína-alvo e remoção de endotoxina a partir de um extrato de E. coli não clarificado em apenas uma etapa.