Desenvolvimento de Nested-PCR para identificação do grupo Apicomplexa e de espécies de Plasmodium spp. que causam infecção humana - Souza, Maria Fernanda Bezerra de (2021)
As doenças causadas por protozoários do grupo Apicomplexa tem alta prevalência no Brasil e, muitas vezes, a identificação desses organismos não é simples, o que dificulta o diagnóstico. Dentro do grupo Apicomplexa, temos o gênero Plasmodium, que compreende o grupo de causadores da malária, uma das doenças parasitárias que causa o maior número de óbitos mundialmente. Atualmente, sete espécies do gênero Plasmodium são observadas infectando seres humanos: Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium knowlesi, Plasmodium cynomolgi e Plasmodium simium. A identificação desses protozoários ainda é um desafio, sobretudo quando se pretende identificar no nível de espécie. Nesse contexto, por meio do presente trabalho, foram desenvolvidos dois novos sistemas: (1) uma nested-PCR para identificação de Apicomplexa com base no marcador 18S rDNA, e (2) uma nested-PCR para identificação das principais espécies de Plasmodium que ocorrem no Brasil. O sistema para identificação de Apicomplexa foi validado primeiramente in silico e foram identificadas regiões no gene para 18S rDNA que permitiram discriminar os principais elementos desse grupo. Para validação in vitro foram utilizadas amostras contendo DNA humano, de P. falciparum e Toxoplasma gondii. O sistema desenvolvido foi comparado aos sistemas de marcadores utilizados internacionalmente como referência. Os iniciadores usados na PCR para detecção dos Apicomplexa não amplificaram o DNA humano, o que permitiu maior sensibilidade e especificidade quando comparados aos iniciadores referência. Uma vez finalizado o desenvolvimento do sistema para identificação do grupo Apicomplexa, iniciou-se o desenvolvimento de um sistema que permitisse a discriminação dentro do gênero Plasmodium. Para isso, em uma abordagem inicial in silico, foram selecionados marcadores que pudessem discriminar as diferentes espécies de Plasmodium que causam malária humana, por meio dos bancos de dados GenBank e plasmoDB, e os dados foram processados em programas para o alinhamento e comparação entre as sequências como o MAFFT e o Geneious. O gene escolhido como marcador molecular para o Plasmodium foi o Merozoite Surface Protein 1 (MSP1). O conjunto dos iniciadores para identificação de Plasmodium foi construído de forma a produzir amplicons de tamanhos diferentes para cada uma das seis espécies, possibilitando a identificação das seis espécies de Plasmodium (P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. knowlesi e P. cynomolgi) sem a necessidade de sequenciamento. A nested-PCR para identificação do P. vivax e P. falciparum foi validada in vitro por meio dos testes de limite de detecção, gradiente da temperatura de anelamento e teste de especificidade. Os iniciadores específicos para P. vivax e P. falciparum foram validados por meio da verificação da amplificação, a partir de amostras de cultura de células infectadas e de pacientes. As nested-PCR foram eficientes para discriminação entre P. vivax e P. falciparum, e considera-se que elas poderão ser ferramentas úteis para o diagnóstico da malária no Brasil. Dessa forma, sugere-se a aplicação conjunta do sistema para o alvo 18S rDNA, que poderá ser usado como uma triagem inicial visando a detecção dos parasitos do grupo Apicomplexa, seguida da utilização do alvo MSP1 para determinação da espécie de Plasmodium.