Identificação e caracterização funcional de variantes genéticas regulatórias da expressão gênica na hipercolesterolemia familiar - Araújo, Jéssica Nayara Góes de (2023)
A hipercolesterolemia familiar (HF) é um distúrbio hereditário do metabolismo do colesterol, caracterizado por exposição prolongada a concentrações séricas elevadas do colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL), que leva ao aumento significativo do risco de morbidade cardiovascular e mortalidade precoce. A principal causa da HF são variantes genéticas encontradas nos genes envolvidos na via remoção das partículas de LDL da circulação sanguínea (LDLR, APOB e PCSK9), contudo, variantes causais não são encontradas em uma parcela significativa de indivíduos diagnosticados clinicamente. De forma que, variantes em regiões que não costumam ser incluídas nos painéis de diagnóstico, poderiam estar influenciando a expressão desses genes e contribuindo para o fenótipo. O presente estudo objetivou identificar e caracterizar funcionalmente variantes genéticas localizadas a montante de genes relacionados a HF. 25 voluntários diagnosticados clinicamente com HF, mas sem diagnóstico molecular confirmatório foram selecionados para sequenciamento direcionado de regiões 3 kb a montante dos genes LDLR, APOB e PCSK9 (Chr19:11086362-11089361; Chr2:21044074- 21047073; Chr1:55036476-55039475 - GRCh38) usando o método AmpliSeq for Illumina e o Miseq Reagent Nano Kit v2. A análise computacional dos resultados do sequenciamento incluiu pré-processamento, mapeamento das leituras geradas, chamada de variante e inspeção visual dos alinhamentos para confirmar a qualidade da chamada de variante. Variantes potencialmente regulatórias foram priorizadas de acordo com algoritmo de predição de probabilidade regulatória, anotação funcional com dados de bancos públicos, algoritmos de predição de patogenicidade, literatura relacionada à variante e predição alteração na ligação de fatores de transcrição. O efeito da presença de duas dessas variantes potencialmente regulatórias no funcionamento dos promotores de seus genes alvo foi avaliado por ensaio de gene repórter da luciferase em células HepG2. 34 variantes de um único nucleotídeo (SNV) identificadas no sequenciamento, passaram nos filtros de qualidade: 6 a montante do LDLR, 15 do APOB e 13 no PCSK9. 5 variantes foram consideradas potencialmente regulatórias e, consequentemente, boas candidatas para os ensaios de validação funcional: rs36218923-T e rs538300761-T do LDLR; rs934197-T e rs9282606-A do APOB; e g.55038486A>G do PCSK9. Nos ensaios in vitro, a presença da variante rs36218923-T causou uma redução média significativa da atividade da luciferase (75,4% ± 2,9% SEM) em relação a construção contendo o promotor selvagem do LDLR. Enquanto, a variante rs934197-T não causou uma diferença significativa na atividade média da luciferase em comparação com a construção contendo o promotor selvagem do APOB. Esses resultados sugerem que a variante rs36218923-T pode estar contribuindo para a diminuição da expressão do gene LDLR e causando o fenótipo da HF. Mais estudos corroborando esses achados são necessários para confirmar a relevância biológica dessa variante.