Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi - Leitão, Ana Laura Oliveira de Sá (2017)
Com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, é crescente o interesse por antígenos recombinantes purificados para obtenção de vacinas. Porém, para essa aplicação esses antígenos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso é de grande relevância o desenvolvimento de técnicas que permitam a redução do número de operações unitárias necessárias ao processo de purificação, permitindo ainda uma elevada recuperação e proporcionando uma maior economia na obtenção dos bioprodutos. A Adsorção em Leito Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa propícia para o downstream processing, pois é uma técnica cromatográfica de modo simples e de baixo custo, que integra as etapas de clarificação, concentração, purificação em uma única operação. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em resina Streamline chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacarídeos (LPS) liberados durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor método de rompimento celular para obtenção da proteína intracelular. As estratégias estudadas utilizando lisozima, pérolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas através de quatro planejamentos experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsorção em batelada, utilizando-se cinco íons metálicos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor adsorção do antígeno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de lavagem da ALE para remoção do LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados ensaios de ALE visando recuperar e purificar a proteína de interesse. Para os ensaios usando ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba peristáltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avaliação do rompimento celular, observou-se que maiores quantidades de proteínas totais e do antígeno 503 liberadas foram obtidas para o método da ureia e que o único fator significativo para esse planejamento foi a concentração, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do íon metálico, o cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsorção do antígeno 503, apresentando valores de capacidade de adsorção de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente para as concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as três condições analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o percentual de remoção de LPS foi elevado e que a concentração mínima utilizada (0,01 %) já foi suficiente para a remoção de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando eluição isocrática (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recuperação (3,0 %) do antígeno 503. Avaliou-se então a eluição em degrau, inicialmente em dois passos, aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Porém, esta estratégia ainda não foi eficiente para recuperar a proteína de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total de três passos de eluição, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse último teste mostrou uma recuperação de 15,0 % da proteína de interesse e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0. Portanto, a técnica cromatográfica de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação e purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado.