Diversidade e evolução do nono e décimo passos da via biossintética de purinas em procariotos - Cruz, Dennifier Costa Brandão (2018)
A via biossintética de purinas (VBP) inicia a partir do fosforibosil pirofosfato (PRPP) que é convertido à inosina monofosfato (IMP) em 10 etapas enzimáticas, em 4 dessas etapas as enzimas envolvidas podem variar de acordo com o grupo taxonômico. Nas bactérias e eucariotos o nono e décimo passo são realizados preferencialmente pela enzima PurH e nas archaeas pela PurP e PurO respectivamente. A PurH tem dois domínios, o AICARFT que realiza o nono passo e o IMPCH que realiza o decimo passo, esses domínios recentemente foram encontrados em espécies do Domínio Archaea como genes independentes não fusionados. A PurP e PurO são análogas aos domínios da PurH e até então consideradas assinaturas do Domínio Archaea. No primeiro capítulo desse trabalho foi realizada um estudo da distribuição dos genes relacionados com os últimos passos da VBP (purH, purP, purO e os genes que codificam AICARFT e IMPCH nomeados de purV e purJ, respectivamente) em 1405 genomas completamente sequenciados dos Domínios Archaea e Bacteria. As análises de genômica comparativa indicaram que a PurH foi preferencialmente a solução evolutiva do Domínio Bacteria para catalisar as reações enzimáticas das últimas etapas da VBP. Homólogos dos genes purO, purV e purJ foram encontrados em genomas bacterianos indicando que esse genes não são exclusivos do domínio Archaea. Também foi observado que existe padrão taxonômico para ocorrência desses genes e que em algumas espécies eles estão no mesmo contexto genômico que outros genes da VBP. Apesar de apresentarem o mesmo padrão de conservação da estrutura primária, os homólogos da PurO do Domínio Archaea e Bacteria não estão relacionados e formaram grupos distintos na árvore filogenética, devido a isso podemos inferir que a PurO já existia no ancestral comum de todos os seres vivos. Por outro lado a PurP parece ter surgido após a divergência das archaeas, e suas isoformas foram originadas a partir de eventos de duplicação gênica. O objetivo do trabalho apresentado no segundo capítulo foi compreender a história evolutiva das PurVs e PurJs e suas relações evolutivas com os domínios AICARFT e IMPCH das PurHs. A genômica comparativa foi realizada com 2735 genomas, apesar do número de genomas analisados ser quase o dobro, os resultados observados para a distribuição de purH, purV, purJ, purP e purO nas linhagens procarióticas foram similares aos apresentados no primeiro capítulo. A análise dos aminoácidos do sítio ativo mostrou que apesar de algumas variações, existem aminoácidos conservados entre AICARFTs/PurVs e IMPCHs/PurJs, inclusive aminoácidos que foram descritos como essenciais para a atividade do AICARFT. De acordo com a literatura a maioria dessas variações são possíveis do ponto de vista físico-químico, além disso, elas são equivalentes entre AICARFTs/PurVs e IMPCHs/PurJs. A topologia da árvore filogenética das PurHs mostra uma clara separação entre Gram positivas e Gram Negativas sugerindo que as PurHs atuais originaram de um único evento de fusão gênica. As análises filogenéticas indicaram que as PurHs das archaeas são filogeneticamente relacionadas com as PurHs de Gram Negativas o que indica que elas foram adquiridas por transferência horizontal. Esse resultado é coerente com a hipótese de que o evento de fusão gênica que originou a PurH ocorreu no Domínio Bacteria. A partir da filogenia podemos inferir que a PurV provavelmente tenha sido originada a partir do domínio ancestral que originou a PurH e a PurJ a partir de quebras do gene da PurH ao longo da evolução e diversificação das linhagens procarióticas. CAPÍTULO 1 = As duas últimas etapas da via biossintética das purinas podem ser catalisadas por diferentes enzimas em procariotos. Os genes que codificam essas enzimas incluem homólogos de purH, purP, purO e aqueles que codificam os domínios AICARFT e IMPCH de PurH, aqui denominados purV e purJ, respectivamente. Em bactérias, essas reações são catalisadas principalmente pelos domínios AICARFT e IMPCH de PurH. Em Archaea essas reações podem ser realizadas por PurH e também por PurP e PurO, ambas consideradas assinaturas desse domínio e análogas aos domínios AICARFT e IMPCH de PurH, respectivamente. Esses genes foram pesquisados em 1.405 genomas procarióticos completamente sequenciados e disponíveis publicamente. Nossas análises revelaram padrões taxonômicos para a distribuição desses genes e anticorrelações em sua ocorrência. As análises dos genomas bacterianos revelaram a existência de genes que codificam PurV, PurJ e PurO, que não podem mais ser considerados assinaturas do domínio Archaea. Embora geneticamente não relacionados, os PurOs de Archaea e Bacteria apresentam um alto nível de conservação nos aminoácidos dos sítios ativos da proteína, permitindo concluir que essas enzimas são análogas. O gene purO estava presente no ancestral comum de todos os seres vivos, enquanto a codificação do gene PurP surgiu após a divergência de Archaea e Bacteria e suas isoformas originadas em eventos de duplicação no ancestral comum dos filos Crenarchaeota e Euryarchaeota. Os resultados relatados aqui expandem nossa compreensão da diversidade e evolução das duas últimas etapas da via biossintética da purina em procariotos. CAPÍTULO 2 = O estudo da via biossintética de purinas (VBP) tem contribuído de forma significativa no desenvolvimento de fármacos anticâncer, antimicrobianos, na área da biotecnologia proporcionando a produção de compostos de valor comercial a partir de microrganismos, e também na área agrícola, uma vez que suas enzimas estão diretamente relacionadas a fatores como crescimento e virulência de fitopatógenos. O fosforribosil-pirofosfato (PRPP) é o precursor da via de purinas, ele é convertido a inosina-monofosfato (IMP) através de 10 etapas enzimáticas. O nono e décimo passos da VBP é originalmente realizado pela PurH nas Bactérias e pela PurP e PurO nas Archaeas, respectivamente. No capítulo 1 relatamos a existência da PurO, PurV e PurJ no Domínio Bacteria, novas enzimas da VBP que provavelmente também estão relacionadas com o nono e décimo passo da via. Como discutido anteriormente a PurV e PurJ são homólogos aos domínios AICARFT e IMPCH da PurH entretanto ainda não se sabe qual teria sido a origem delas, se foram originados a partir dos domínios ancestrais que deram origem a PurH ou a partir de quebras do gene da PurH, devido a isso o objetivo desse trabalho foi primeiramente compreender melhor a diversidade dos genes envolvidos com o nono e décimo passos da VBP nos genomas procarióticos, buscar evidencias que nos permitam inferir que PurV e PurJ são ativas na via e entender a relação evolutiva existente entre elas e a PurH. Foi realizada uma genômica comparativa com 2735 genomas procarióticos completamente sequenciados, buscando pelos genes purH, purV, purJ, purP e purO. Apesar do número de genomas ser quase o dobro do capítulo 1 os resultados da genômica comparativa foram basicamente os mesmos. Foi realizada uma análise dos aminoácidos do sítio ativo dos AICARFTs e IMPCHs de todas as PurHs recuperadas e PurVs e PurJs recuperados, com isso foi possível observar que apesar de algumas variações existe conservação de aminoácidos do sítio ativo de PurV e PurJ inclusive de aminoácidos que foram descritos como essenciais para a atividade da enzima. O padrão de conservação da estrutura primária de AICARFTs/PurVs e IMPCH/PurJ é similar, eles apresentam basicamente as mesmas regiões conservadas. Na árvore da PurH foi possível observar uma clara divisão entre Gram positivas e Gram negativas. Dos 32 filos amostrados apenas 8 foram monofiléticos para PurH, entretando a monofilia foi observada também em taxas inferiores como família, ordem ou classe. As PurHs de Archaea ficaram dispersas e provavelmente teriam sido adquiridas a partir de transferência lateral de genes. A topologia que a árvore das PurJs com os domínios IMPCHs das PurHs assumiu, reflete que os purJs não tiveram uma única origem e provavelmente surgiram a partir de quebras de purH, uma vez que parte deles agruparam com os IMPCHs do mesmo filo. A PurV por outro lado formou grupos distintos na árvore e não estão relacionados com os AICARFTs das PurHs, indicando que provavelmente tenham sido originadas a partir do domínio ancestral.