Identificação de resíduos de aminoácidos importantes para a ativação de NifA po PII em Herbaspirillum seropedicae - Stefanello, Adriano Alves (2014)
Resumo: Herbaspirillum seropedicae (?-Proteobacteria) é um diazotrofo encontrado em associação com gramíneas de interesse econômico, como milho e cana-de-açúcar. A fixação de nitrogênio em H. seropedicae é controlada a nível transcricional pela proteína NifA. NifA é inativa sob alta concentração de nitrogênio fixado, e essa sensibilidade é atribuída ao domínio N-terminal. A desrepressão de NifA depende da interação de seu domínio N-terminal com a proteína GlnK, pertencente à família das proteínas PII, mas os mecanismos dessa interação ainda não foram elucidados. Neste trabalho, foram construídos plasmídeos capazes de co-expressar a proteína NifA e diferentes proteínas PII de H. seropedicae, Escherichia coli, e Azospirillum brasilense a partir do promotor T7. A capacidade dessas proteínas PII de ativar NifA foi medida em E. coli JM109(?DE3) contendo o plasmídeo pRT22 (nifH::lacZ) através do ensaio de atividade de ?-galactosidase. Os resultados mostraram que GlnB dos três organismos e GlnK de H. seropedicae foram capazes de ativar NifA, ao passo que GlnZ de A. brasilense não o foi. Uma série de mutantes pontuais de GlnK de H. seropedicae foi construída, substituindo resíduos conservados em GlnB e GlnK pelos resíduos equivalentes em GlnZ de A. brasilense; a avaliação de atividade revelou que mutações na região C-terminal da proteína não aboliram a ativação de NifA por GlnK, indicando que essa região não deve ser responsável pela ativação. Outras proteínas GlnK mutantes incapazes de modificação pós-traducional (Y51F) e de ligação a ATP/ADP (G89A) foram avaliadas conforme já descrito. GlnK G89A é incapaz de ativar NifA em quaisquer condições testadas, ao passo que GlnK Y51F ativa fracamente NifA, e apenas em baixas concentrações de nitrogênio. A ativação de NifA por GlnK Y51F aumenta conforme o aumento de expressão desta. Variantes de GlnK contendo mutações que afetam a região de ligação a efetores também apresentaram diminuição da ativação de NifA. Isso sugere que a ligação de efetores a PII é essencial para a ativação de NifA, e que a uridililação não é essencial para a ativação.