Avaliação de diferentes protocolos visando o estabelecimento de uma linhagem celular a partir de ovos e larvas de abelhas Apis mellifera africanizadas - Frühauf, Matheus Iuri (2021)
As abelhas são muito importantes para o ser humano e para o meio ambiente, em função do papel fundamental que desempenham, através da polinização. Entretanto, vem sendo relatada, em todo o mundo, uma diminuição significativa de colônias da espécie Apis mellifera, causada por diversos fatores, entre eles, infecções virais. Para estudo e diagnóstico de enfermidades causadas por vírus utiliza-se o cultivo celular in vitro. Atualmente, existem apenas duas linhagens celulares de Apis mellifera, entretanto, essas linhagens não estão disponíveis comercialmente, além de serem permanentemente infectadas pelo vírus deformador de asas, o que impossibilita seu uso, especialmente em pesquisas relacionadas às interações célula-patógeno ou entre patógenos. O objetivo desta dissertação foi padronizar técnicas para o desenvolvimento de cultivos primários, de fácil e prática utilização, com o intuito de posterior imortalização celular, visando o desenvolvimento de uma ou mais linhagens celulares da espécie Apis mellifera. Para a obtenção de uma linhagem contínua a partir de cultivos primários, descrevemos cinco agentes de imortalização celular. Atualmente, as técnicas de imortalização celular utilizadas em cultivos celulares de insetos são adaptadas daquelas utilizadas em células de mamíferos. Cada técnica apresenta vantagens, limitações, praticidades e implicações genotípicas e fenotípicas. A escolha da técnica de imortalização é uma etapa fundamental e desafiadora no desenvolvimento de uma linhagem celular, visto que ela deve, idealmente, possibilitar longos períodos de viabilidade celular, com elevado número de passagens, além de manter o genótipo e fenótipo das células semelhante ou idêntico ao tecido original. Para a elaboração dos cultivos primários, foram avaliados os meios Grace, Leibovitz e Schneider, suplementados com soro fetal bovino e antibióticos. Foram, também, avaliadas técnicas para manutenção e criopreservação de cultivos celulares originados de ovos e larvas de abelhas Apis mellifera. Para manutenção, foram avaliadas técnicas de tripsinização, uso de espalhador celular e também de centrifugação do conteúdo celular. Com relação à criopreservação, foram avaliadas duas diferentes soluções de congelamento. Através das técnicas descritas, foram desenvolvidos 79 cultivos celulares, com até 19 passagens utilizando o meio Grace, e com viabilidade celular de até 140 dias com o meio Schneider. A utilização de larvas nos cultivos primários, demonstrou maior taxa de proliferação, e longevidade celular, quando comparado com a utilização de ovos. Dentre os meios avaliados, a utilização do meio Grace na elaboração de cultivos primários apresentou maiores taxas de proliferação celular e replicabilidade, demonstrando ser uma ótima opção para a aplicação das técnicas de imortalização celular. A utilização de tripsina, durante amanutenção dos cultivos, demonstrou elevada morte celular, sendo substituída por espalhadores celulares. A solução de criopreservação utilizando 10% de DMSO e 90% de soro fetal bovino, propiciou a criopreservação de cultivos celulares por oito meses.