Atividade inseticida e mecanismos de ação de lectinas de Myracrodruon urundeuva contra Nasutitermes corniger, Aedes aegypti e Sitophilus zeamais - Napoleão, Thiago Henrique (2012)
Lectinas, proteínas que ligam específica e reversivelmente a carboidratos, isoladas da entrecasca (MuBL) e do cerne (MuHL) da aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) foram agentes inseticidas contra operários e soldados de Nasutitermes corniger (MuHL) e larvas de Aedes aegypti (MuBL e MuHL). A presente Tese descreve a purificação da lectina de folha de M. urundeuva (MuLL), a atividade termiticida de MuBL e MuLL sobre N. corniger, a atividade larvicida de MuLL sobre larvas de A. aegypti no quarto estágio (L4), o efeito de MuLL sobre o gorgulho do milho (Sitophilus zeamais) e o estudo dos potenciais mecanismos de ação inseticida. O procedimento de purificação de MuLL incluiu extração de proteínas das folhas com NaCl 0,15 M, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia em coluna de quitina. MuLL foi caracterizada quanto ao perfil eletroforético em condições nativas e desnaturantes, bem como quanto ao efeito de carboidratos, temperatura e pH sobre a atividade hemaglutinante. Ensaio de determinação da atividade termiticida de MuBL e MuLL foi realizado em placas de Petri contendo discos de papel de filtro impregnados com diferentes quantidades de lectina. Quanto aos mecanismos de ação sobre os cupins, foram investigados a resistência das lectinas à degradação proteolítica e os efeitos das mesmas sobre bactérias simbiontes do trato intestinal. Para determinação da atividade larvicida contra A. aegypti, larvas L4 foram incubadas por 24 h em soluções contendo diferentes concentrações do extrato de folhas ou de MuLL isolada. A resistência de MuLL à proteólise e o efeito da lectina sobre as atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina e -amilase) das larvas foram investigados. Para determinação da atividade inseticida contra S. zeamais adultos o extrato ou MuLL foram incorporados a discos de farinha de trigo que serviram como dieta para os insetos durante 7 dias. Os parâmetros avaliados foram sobrevivência, índice de deterrência alimentar, taxa de consumo relativo, taxa de crescimento relativo, eficiência na conversão do alimento ingerido e atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina, celulases, fosfatases e -amilase). MuLL, uma lectina ligadora de quitina, é um polipeptídeo catiônico, glicosilado, de massa molecular 14,2 kDa cuja atividade hemaglutinante é inibida por glicoproteínas e estável ao aquecimento a 100 °C e em ampla faixa de pH. Atividade termiticida foi detectada para MuBL (CL50 de 0,974 mg/mL sobre operários e 0,787 mg/mL sobre soldados) e MuLL (CL50 de 0,374 mg/mL sobre operários e 0,432 mg/mL sobre soldados). As atividades hemaglutinantes de MuBL, MuHL e MuLL foram resistentes a extratos de intestino de N. corniger contendo atividade de tripsina e as três lectinas apresentaram ação bacteriostática (concentração mínima inibitória de 62,5 μg/mL para bactérias de operários e 125 μg/mL para bactérias de soldados). MuBL e MuHL foram agentes bactericidas mais eficientes sobre simbiontes de operários (concentração mínima bactericida de 125 μg/mL) do que MuLL (250 μg/mL), enquanto as três lectinas apresentaram atividade bactericida similar sobre as bactérias do intestino dos soldados (concentração mínima batericida de 250 μg/mL). O extrato de folhas e MuLL foram larvicidas contra A. aegypti com CL50 de 10,9 e 0,202 mg/mL, respectivamente. Estes resultados indicam MuLL como princípio ativo do extrato de folhas. MuLL foi resistente a hidrólise pelas enzimas do intestino das larvas, inibiu a atividade proteolítica total e de tripsina (Ki: 2,8 μM) e estimulou a atividade de -amilase das larvas. O extrato de folhas matou S. zeamais (CL50 de 72,4 mg de proteínas/g de farinha de trigo) e apresentou efeito deterrente alimentar moderado enquanto MuLL apenas exerceu forte efeito deterrente (índices de deterrência de 82% a 91% em concentrações de 45 a 150 mg/g). A toxicidade do extrato e o efeito deterrente de MuLL resultaram em perda de biomassa pelos insetos, o que foi refletido em valores negativos para as taxas de crescimento relativo e eficiências de conversão do alimento ingerido. As atividades de proteases, tripsina, fosfatase ácida e amilase em extratos do intestino de adultos alimentados com dieta contendo o extrato ou a lectina foram significativamente (p<0,05) menores que aquelas detectadas em extratos do intestino de insetos do grupo controle. A ingestão de dieta contendo MuLL resultou também em diminuição das atividades de endoglucanase e fosfatase alcalina. Em conclusão, os resultados obtidos revelam (1) MuHL, MuBL e MuLL como potenciais candidatos a inseticidas biodegradáveis para controle de N. corniger, A. aegypti e S. zeamais; (2) resistência das lectinas ao ambiente proteolítico do intestino de N. corniger e A. aegypti; (3) modulação de atividades de enzimas digestivas do intestino de insetos pelas lectinas; (4) atividade antibacteriana de MuHL, MuBL e MuLL sobre microorganismos intestinais simbiontes de N. corniger; (5) atividade inseticida contra N. corniger e A. aegypti por ingestão das lectinas e contra S. zeamais por rejeição da dieta contendo MuLL. A Tese contribui para o “estado da arte” no estudo da atividade inseticida de lectinas, fornecendo os primeiros dados para a compreensão dos mecanismos envolvidos nos efeitos deletérios exercidos por estas proteínas sobre N. corniger, A. aegypti e S. zeamais.