Constituintes químicos da madeira-de-lei Myracrodruon urundeuva com propriedades antioxidantes e ação contra Fungos, Bactérias e Insetos - SÁ, Roberto Araújo (2008)
Sabe-se que algumas árvores, como a aroeira-do-sertão, Myracrodruon urundeuva, apresentam madeira que não é atacada por agentes biodeterioradores. O conhecimento da resistência natural da madeira é importante na recomendação de sua utilização, para evitar gastos com a reposição de peças deterioradas e reduzir os impactos sobre as florestas remanescentes. Os extrativos de madeiras são conhecidos por aumentar a durabilidade e sugere-se que compostos com atividades antioxidante, antimicrobiana e inseticida também protegem o cerne. Dentre os componentes do metabolismo primário das plantas, algumas proteínas têm sido relacionadas a mecanismos de defesa, como as lectinas, proteínas que se ligam a carboidratos. Os objetivos desse trabalho foram (A) analisar fitoquimicamente e avaliar a propriedade antioxidante de preparações do cerne de M. urundeuva e (B) isolar, caracterizar parcialmente e avaliar potencial biotecnológico e atividades biológicas de uma lectina isolada do cerne. Pó do cerne de M. urundeuva foi utilizado na preparação dos extratos metanólico (EM) e salino NaCl 0,15 M (ES; 10%, p/v). Os extratos foram avaliados quanto à presença de extrativos e metabólitos secundários e quanto à capacidade de capturar radicais livres (atividade antioxidante). A presença de lectinas em ES foi detectada através do ensaio de atividade hemaglutinante (AH). As proteínas presentes em ES foram precipitadas com sulfato de amônio. A fração 40-60% (F1), de maior AH específica (AHE), foi avaliada quanto à presença de metabólitos secundários e atividade antioxidante. AH de F1 foi avaliada em presença de carboidratos e glicoproteínas. F1 foi aplicada em coluna de quitina (polímero de N-acetil-glicosamina, GlcNAc) equilibrada com NaCl 0,15M. O pico protéico ativo eluído com ácido acético 1,0 M foi definido como a lectina de cerne de M. urundeuva (MuHL). A afinidade da lectina por GlcNAc foi também avaliada através da eluição da coluna de quitina com solução de GlcNAc 0,1 M e por cromatografia de F1 em coluna desse monossacarídeo imobilizado em agarose. A massa molecular nativa de MuHL foi obtida através de cromatografia de exclusão molecular em coluna Hiprep 16/60 Sephacryl S-300/Äkta-FPLC. MuHL foi analisada em eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas nativas básicas ou ácidas e em condições desnaturantes e redutoras (SDS-PAGE). MuHL também foi avaliada quanto à natureza glicoprotéica. A AH de MuHL em presença de íons, a estabilidade térmica da lectina e o efeito do pH sobre a AH foram avaliados. MuHL foi imobilizada em Sepharose CL-4B, para ser utilizada no isolamento de glicoproteínas, e conjugada à peroxidase para utilização como marcador histoquímico de tecidos de próstata (normal, hiperplasia benigna e carcinoma) e do hipocampo de pacientes com Mal de Alzheimer. Atividade antibacteriana de MuHL foi avaliada frente a bactérias Gram-positivas (Bacillus subtilis, Corynebacterium callunae, Staphylococcus aureus e Streptococcus faecalis) e Gram-negativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa). As concentrações mínimas inibitória (CMI), bactericida (CMB) e aglutinante (CMA) foram determinadas. Atividade antifúngica contra Fusarium (F. solani, F. oxysporum, F. moniliforme, F. decemcellulare, F. lateritium, F. fusarioides e F. verticiloides) e atividades inseticida e repelente contra cupins Nasutitermes corniger de MuHL foram avaliadas. A concentração que mata 50% dos insetos (CL50) foi determinada. MuHL também foi avaliada quanto à atividade larvicida contra larvas no quarto estágio (L4) de Aedes aegypti e as CL16, CL50 e CL84 foram calculadas. ES e EM apresentaram flavonóides, proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas. Ação antioxidante de EM e ES foi evidenciada pela capacidade dos extratos de captar 8 radicais livres DPPH. A quantidade de radicais que reagiu com EM e ES foi bastante elevada (91,1% e 84,5,%, respectivamente), enquanto que com F1 foi muito baixa (11,2%). ES, F1 e MuHL aglutinaram eritrócitos de todos os tipos sangüíneos do sistema ABO, assim como eritrócitos de coelho. A AH de F1 foi inibida parcialmente por GlcNAc (estimulando a purificação da lectina por cromatografia de afinidade em coluna de quitina) e pelas glicoproteínas fetuína, ovoalbumina, tiroglobulina e azocazeína. A avaliação fitoquímica de F1 demonstrou somente resquícios de leucoantocianidinas. MuHL, recuperada da cromatografia em coluna de quitina com AHE de 2.560, foi inibida por N-acetil-glicosamina. Eluição com solução de GlcNAc também resultou em recuperação da AH e a lectina também adsorveu à matriz Agarose-GlcNAc. MuHL se apresentou como uma glicoproteína básica constituída de um único polipeptídeo de aproximadamente 14,4 kDa (em SDS-PAGE). O perfil cromatográfico de MuHL na cromatografia de exclusão molecular revelou um pico principal de 21 kDa. Ensaios indicaram que a lectina é termoresistente (30-100 ºC) e sensível à variação de pH, apresentando maior AH em pH 5,5. A AH de MuHL, após diálise contra o agente quelante EDTA, foi estimulada por Ca+2, Mg+2 e Mn+2. A matriz MuHL-Sepharose foi capaz de reter as glicoproteínas comerciais fetuína, tireoglobulina e ovoalbumina, assim como glicoproteínas presentes no homogenato da tireóide de porco, soro fetal bovino e extrato da clara de ovo. MuHL marcou de forma intensa e homogênea a membrana das células de tecidos de hiperplasia benigna prostática e hipocampo de pacientes com o Mal de Alzheimer. A inibição por GlcNAc e a capacidade de se ligar à quitina estimularam a avaliação das propriedades antimicrobiana e inseticida da lectina. MuHL apresentou atividade antifúngica após 72 horas contra todas as espécies de Fusarium. ES, F1 e MuHL apresentaram efeito antibacteriano sobre todas as bactérias testadas. A maior ação inibitória de MuHL foi para S. aureus (CMI: 0,58 μg/mL; CMB: 8,1 μg/mL). MuHL também aglutinou todas as bactérias, sendo S. aureus a espécie mais sensível (CMA: 2.34 μg/mL). O contato com MuHL em todas as concentrações testadas induziu 100% de mortalidade dos operários e soldados. Os valores de CL50 após 4 dias foram de 0,248 mg/mL para os operários e 0,199 mg/mL para os soldados. MuHL não apresentou efeito repelente. A lectina também apresentou atividade larvicida sobre A. aegypti. Os valores de CL16, CL50 e CL84 foram de 0,03, 0,04 e 0,05 mg/ml. O estudo revelou a presença de compostos com potente atividade antioxidante e contribuiu para a construção de um painel sobre lectinas de plantas ao caracterizar a lectina isolada. A lectina de M. urundeuva é o primeiro peptídio bioativo encontrado em um cerne e em um tecido de uma madeira-de-lei. Por suas propriedades antimicrobiana e inseticida, MuHL é, provavelmente, um dos componentes da barreira química que confere a elevada resistência da madeira da aroeira-do-sertão à biodegradação. MuHL também é a primeira lectina com atividade inseticida descrita para cupins e A. aegypti. Em resumo, o trabalho ressalta a importância do estudo das propriedades dessa planta, ameaçada de extinção, tanto para o entendimento da fisiologia das plantas resistentes quanto como uma potencial fonte de lectina que pode ser explorada do ponto de vista biotecnológico