Quitinases de tomateiro (Solanum lycopersicum L.): identificação, caracterização e atividade no controle do Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici - AMARAL, Daniel Oliveira Jordão do (2012)
A murcha de fusário, causada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol), é uma importante doença para a cultura do tomate, sendo a utilização de cultivares resistentes a melhor estratégia para o controle desse patógeno. A transformação genética de plantas constitui instrumento biotecnológico essencial para o melhoramento, pela introdução de genes exógenos, manutenção das características originais da variedade e encurtamento do tempo para obtenção de uma nova cultivar. Um dos maiores obstáculos para a manutenção dessa resistência reside na busca de genes alvos envolvidos na defesa em plantas e monitoramento da variabilidade dos fitopatógenos. Assim, este estudo foi conduzido com o objetivo de determinar a variabilidade genética de diferentes isolados das três raças de Fol, mediante marcadores moleculares, caracterizar um gene diferencialmente expresso isolado de um genótipo resistente não comercial submetido ao ataque de fusário e de transferir, via transformação genética, esse gene para uma cultivar comercial sensível ao fungo. Analisando a variabilidade genética de isolados pertencentes às três raças de Fol utilizando marcadores moleculares RAPD e IGS, foi demonstrado que a raça 3 é distinta das demais raças, estabelecendo um agrupamento das raças 1 e 2. Devido ao fato das cultivares comerciais com resistência às raças 2 e 3 de Fol, ainda não estarem amplamente disponíveis, com o objetivo de identificar genes envolvidos em defesa, foi construída uma biblioteca de cDNA usando hibridização subtrativa supressiva (Suppresive Subtractive Hybridization, SSH) a partir de um genótipo resistente (genótipo BRH) desafiado com a raça 2 de Fol. Dentre os genes identificados, uma quitinase (SolChi) foi selecionada para verificar respostas no nível da expressão gênica das plantas BRH submetidas à inoculação com a raça 2 de Fol, utilizando a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR), em que a normalização da expressão desse gene foi feita a partir da expressão do fator de elongação α1 (EF-1α) de tomate, classificado como gene housekeeping. Observou-se o aumento da expressão do gene SolChi após 24 horas da inoculação do fitopatógeno em tecido radicular quando comparado com as plantas controles. O gene SolChi foi transferido para a cultivar comercial Santa Clara, sensível à murcha de fusário, por transformação genética via Agrobacterium tumefaciens, estirpe EHA 105, sob o controle do promotor 35S de CaMV duplicado, superexpressando esse gene. Mudas transgênicas (T0) foram confirmadas por PCR, usando primers específicos, para o transgene e a frequência de transformação obtida foi de 7%. A transformação e transcrição dos transgenes foram confirmadas em T1 por PCR e transcrição reversa- PCR (RT-PCR) respectivamente. A resistência ao patógeno será, posteriormente, avaliada pela inoculação de isolado da raça 2 de Fol em plantas mantidas in vivo. Isolado da raça 2 de Fol induz a expressão diferenciada do gene de SolChi em raízes de tomateiro genótipo BRH, sugerindo uma possível participação no mecanismo de defesa do tomateiro contra o fusário, indicando um importante alvo para programas de melhoramento, em que também faz-se necessário o estudo constante da variabilidade genética do patógeno.