Purificação e Caracterização de Protease com Atividade Colagenolítica produzida por Actinomadura sp. - SILVEIRA, Luciana Lopes (2015)
As proteases são enzimas proteolíticas, as quais apresentam grande interesse pelas indústrias em diversas áreas. As proteases que possuem a capacidade de degradação da hélice de colágeno tem sido estudadas para a aplicação dos peptídeos de colágeno, no tratamento de doenças como: hipertensão, inibindo a enzima conversora de angiotensina II (ECA), assim como da própria enzima pelas indústrias farmacêuticas em tratamentos de feridas com necrose ou no tratamento da doença de Dupuytren. As proteases com atividade colagenolítica, capazes de degradar o colágeno, podem ser obtidas através de diversas fontes, e dentre estas, os micro-organismos são escolhidos devido à sua diversidade bioquímica e susceptibilidade para a manipulação genética. Devido ao potencial dessas enzimas, existe uma procura de novas fontes microbianas, as quais seja possível obter a protease com rapidez e baixo custo no processo de purificação. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar protease com atividade colagenolítica obtida através da Actinobactéria Actinomadura sp., isolada do solo Licania rígida BETH. O microorganismo foi cultivado em meio a base de farinha de soja, líquido metabólico foi concentrado através do processo de precipitação com acetona (70%), seguida foi purificado parcialmente pelo processo de cromatografia de troca iônica em resina de DEAE-sephadex (G-50). A protease com atividade colagenolítica foi eluida, utilizando gradiente de concentração, com solução de NaCl 0,1M em tampão Tris-HCl, pH 8,0. O cromatograma foi obtido através da leitura no comprimento de onda de 280nm. A tabela de purificação foi obtida através da realização da atividade proteásica, da colagenolítica e da concentração proteica em cada etapa de purificação. Para a determinação do peso molecular e da pureza foi realizado a eletroforese em gel (SDS-page). A caracterização da amostra purificada foi realizada através de ensaios de: termoestabilidade, a enzima foi submetida às termperaturas de 50° - 80°C durante 30 minutos; temperatura ótima, nas temperaturas de 30°C – 80°C; pH ótimo, variando o pH5-6 (0,1M do tampão de ácido acético- acetato de sódio ) e 7-9 ( 0,1M do tampão Tris- HCl); efeito de inibidores, utilizando os inibidores fluoreto de fenilmetanosufonil, dodecil sulfato de sódio, beta- mercaptoetanol e pepstatina em contato com a enzima durante 60 minutos; o efeito de íons metálicos, foi utilizado soluções com ions divalentes ( Fe 2+, Mg 2+, Ca 2+, Zn2+) em contato com a enzima durante 60 minutos; e efeito de frequência ultrassônica, enzima submetida a frequência ultrassônica (40 kHz), em diferentes intervalos de tempo. Os resultados obtidos demonstraram que a protease é possível purificar utilizando o gradiente de de NaCl 0,1M em tampão Tris-HCl, pH 8,0, assim como uma atividade colagenolítica específica de 31.094,89 U/mg de proteína, com um fator de purificação de 9,81. Na eletroforese foi possível observar duas bandas, com pesos moleculares de 20 KDa e 45,0 KDa. A enzima apresentou termoestabilidade até 60°C, a temperatura ótima de atividade em 50°C. Sob condições de variação de pH, a atividade enzimática apresentou maiores atividade colagenolítica em faixa de pH 7 a 8, reduzindo bruscamente em pH 9,0. Quando submetida ao efeito da frequência ultrassônica, a enzima após 10 minutos apresentou aumento de 50% de sua atividade colagenolítica inicial. Sendo assim, essa nova biomolécula apresenta potencial biotecnológico, uma vez que o processo de produção envolve um substrato, a farinha de soja, que é amplamente encontrado no Brasil, e o protocolo de purificação desenvolvido foi eficaz para a obtenção da protease com atividade colagenolítica.