Estudo dos canais iônicos no processo de proliferação e regulação do volume em células-tronco mesenquimais humanas - ALBERTIM, Gisely Juliane Barbosa de (2016)
A regulação do volume celular é importante em vários processos fisiológicos. A diminuição regulatória do volume (RVD) é o processo pelo qual as células recuperam o seu volume após terem sido submetidas a um choque hipoosmótico. Este processo se deve principalmente à liberação de K⁺ e Cl⁻ através de canais e transportadores iônicos. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação dos canais de potássio e canais de cloreto envolvidos na RVD e na proliferação das células-tronco mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical humano (hWJ-MSCs). As hWJ-MSCs foram isoladas de acordo com a técnica de migração espontânea do explante. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 15 % soro fetal bovino, 10 % F-12, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina e mantidas em atmosfera de 5% de CO₂ a 37 °C. Nos experimentos da RVD, as hWJ-MSCs foram depositadas em uma cubeta acoplada a um microscópio invertido com um sistema de vídeo imagem, sendo submetidas inicialmente a um choque hipoosmótico (300 mOsm→200 mOsm) por perfusão. A dinâmica de variação do volume foi monitorada por 30 min e as imagens antes (300 mOsm) e durante o choque hipoosmótico (200 mOsm) foram obtidas a cada minuto e analisadas usando o software ImageJ. As hWJ-MSCs foram submetidas aos seguintes inibidores de canais: tetraetilamônio (TEA) 10 mM, (canal de Kv); glibenclamida (GB) 100 µm, (canal de Kir6.x); 4-aminopiridina (4-AP) 5 mM, (canal de Kv1, KCNA), Iberiotoxina (IBTX) 10 nM (canal BKca), (ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino) benzóico (NPPB), (canal de Cl⁻ ), ácido disulfônico di-isocianatoestilbeno (DIDS) 100 µm e Tamoxifeno (TAM) 10 µm. Posteriormente, as células foram submetidas aos ensaios de MTT, curva de crescimento, quantificação do conteúdo de DNA e RT-PCR. A técnica de patch clamp na configuração Whole-cell foi empregada para caracterização das correntes iônicas. Os dados foram analisados usando o teste t Student’s ou ANOVA, com pós-teste de Tukey ou de Bonferroni. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A RVD presente nas hWJ-MSCs foi suprimida na presença dos inibidores de canais de potássio e de canais de cloreto. As hWJ-MSCs apresentaram três perfis de corrente iônica: Maxi K (BK ou Kca); corrente de potássio transiente de saída (Ito) e uma corrente de retificação tardia (Kᴅʀ). As hWJ-MSCs na presença dos inibidores de canais iônicos reduziram a proliferação permanecendo na fase G0/G1 do ciclo celular. As hWJ-MSCs expressaram os canais de potássio (MaxiK, KCND2, KCND3, KCNS1, KCNH2 e KCNH1) e os canais de cloreto (pl-VDAC e CLCN3). Deste modo, conclui-se que os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv), canais de potássio dependentes de ATP, ativados por cálcio de alta condutância (Kca) e canais de cloreto participam no mecanismo da RVD e consequentemente interferem na proliferação das hWJ-MSCs.