Desenvolvimento de um sistema de pinças ópticas para estudos de interações celulares aplicações em hemoterapia - César Nunes da Silva, Diego (2010)
A pinça óptica (PO) é uma ferramenta que utiliza luz para capturar e mover partículas. Por exercer forças da ordem de Piconewtons sob as partículas capturadas, sua principal aplicação é de interesse microscópico, especialmente no estudo de células e biomoléculas que podem ser manipuladas individualmente sem danos térmicos. Devido a essas características, a PO pode ser utilizada para medir importantes propriedades eritrocitárias, tais como elasticidade e cargas elétricas da membrana. O concentrado de hemácias (CH) é o hemocomponente mais utilizado na prática transfusional. As hemácias quando estocadas sofrem progressiva deteriorização metabólica e celular com diminuição gradual da elasticidade (μ) e da morfologia bicôncava. Por outro lado, a membrana da hemácia é carregada negativamente. Estas cargas influenciam a distribuição de íons ao redor da célula, criando um potencial elétrico repulsivo denominado potencial Zeta (ζ), que atua impedindo a agregação das hemácias na corrente sangüínea. Alterações de cargas nos eritrócitos podem refletir lesões de membrana ocorridas durante o armazenamento. Neste trabalho, realizamos a montagem do sistema de PO e estabelecemos metodologias para quantificar o ζ e μ. Aplicamos essa metodologia para medidas do ζ em hemácias recém coletadas com EDTA e, visando avaliar alterações relacionadas a lesões oxidativas do armazenamento, também realizamos um estudo temporal do ζ e da μ em células do CH coletadas com CPD/SAG-M. O ζ é obtido através da velocidade terminal das células após serem liberadas da armadilha óptica, sob diferentes voltagens. Já a μ é medida movimentando as células aprisionadas com velocidades progressivas e a máxima deformação é registrada. A μ é obtida analisando-se a deformação da hemácia em função da velocidade. Quanto maior for o valor obtido, menos elástica a hemácia. Para todos os estudos realizados, pelo menos 20 células foram analisadas. As medidas do ζ e da μ foram realizadas no primeiro dia de cada semana durante o período de 35 dias. O ζ em EDTA foi -8,0 mV. Para hemácias estocadas em CPD/SAG-M os valores do ζ foram decrescentes a partir do 1º dia de armazenamento. Os valores médios foram de -14,8 mV (1ª semana), da 2ª semana até a 4ª semana de ζ = -10,0 mV, decaindo para valores mais baixos a partir da 5ª semana, estabelecendo assim em - 8,0 mV. Já para a μ, após a primeira 1a semana, o valor médio foi 4,1x10-4 dina/cm, permanecendo constante até o final da 2a semana. Ao final da 3a semana observou-se o valor de 4,6x10-4 dina/cm, ao término da 4a semana de 6,4x10-4 dina/cm, atingindo 9,6x10-4 dina/cm na 5a semana. A redução mais acentuada do ζ na 1ª semana pode ser devido a enzimas liberadas de leucócitos lisados que podem alterar as glicoproteínas da membrana eritrocitária levando a uma redução das cargas negativas. Assim, avaliamos o efeito da leucorredução sobre as cargas elétricas das hemácias estocadas e observamos que as mesmas apresentaram o mesmo perfil de decaimento de cargas que as não deleucocitadas, mostrando que a presença de leucócitos não é a responsável por este decaimento. Visto que a maioria dos testes imunohematológicos de reação antígeno-anticorpo, realizados em bancos de sangue, são baseados no princípio de aglutinação e necessitam da diminuição do ζ para que a reação ocorra, substâncias potencializadoras como a papaína, que atuam diminuindo este ζ são empregadas rotineiramente nestes centros. Como esses testes podem ser realizados em hemácias coletadas em EDTA ou em bolsas de doação e sabendo que hemácias coletadas em EDTA apresentaram valores menores do ζ em relação às em CPD/SAG-M, avaliamos o ζ de hemácias papainizadas coletadas nestes dois meios. Os ζ foram em módulo 3,2 (EDTA) e 4,0 mV (CDP/SAG-M). Esses resultados mostram que mesmo que o ζ seja diferente inicialmente em EDTA e CPD/SAG-M, em ambos os casos ocorre à redução necessária para a que haja a aglutinação. Além disso, observamos que após o tratamento com papaína, algumas hemácias se tornam carregadas positivamente, mas o ζ continua reduzido em módulo. Em conclusão, através da PO foram estabelecidas metodologias sensíveis e capazes de quantificar importantes propriedades eritrocitárias, que poderão contribuir tanto para a compreensão dos efeitos do armazenamento nas cargas de membrana e na elasticidade das hemácias em diferentes e variadas situações, como para a padronização de técnicas de hemaglutinação na rotina transfusional, melhorando a sensibilidade da reação sem perda significativa da especificidade