Produção experimental do antígeno para a prova de imunodifusão em anemia infecciosa equina - Isabella Bias Fortes Ferraz (1990)
Foram produzidos experimentalmente dois tipos de antígenos para o diagnóstico por imunodifusão em gel de ágar (IDGA) da Anemia Infecciosa Eqüina (AIE). O primeiro antígeno foi preparado a partir de baço de cavalos inoculados com a amostra "Wyoming" do vírus. Apresentando um período febril de sete a nove dias, os animais foram sacrificados no 10° dia e os baços foram colhidos assepticamente e congelados a -70°C. A seguir, os baços foram submetidos a vários ciclos de congelamento e descongelamento, tratamento com sulfato de amônia e extração com éter etílico, obtendo-se antígenos parcialmente purificados. A purificação final foi realizada através de cromatografia de afinidade. O segundo antígeno foi preparado a partir de linhagem celular de derme eqüina (EDATCC-57) na 19ª passagem, persistentemente infectada com a amostra "Wyoming" do vírus da AIE. A linhagem infectada foi mantida por 16 subcultivos sem o aparecimento de alterações morfológicas e o antígeno foi detectado no sobrenadante a partir da quinta passagem. Os meios de crescimento e manutenção das células foram submetidos a dois processos de esterilização: a filtração e a autoclavacão. Pode-se observar na pesquisa de antígeno no sobrenadante dos cultivos que, quando foi utilizado o meio autoclavado com 10% de soro fetal bovino, a porcentagem de reações negativas ou fraco positivas foi de 29,41% e com o meio filtrado foi de 5,88%, no total. A introdução de células não infectadas foi empregada a partir da oitava passagem, este cococultivo com células persistentes infectadas apresentou resultados favoráveis já na primeira coleta de sobrenadante. A purificação do antígeno a partir do sobrenadante foi realizada através de tratamento com polietilenoglicol 6000, ultracentrifugação com sacarose a 10% e éter etílico. Uma solução de imunoglobulina G parcialmente purificada com ácido caprílico foi preparada a partir de soro positivo para AIE para ser utilizada como referência positiva nos testes de IDGA. Ambos os antígenos foram avaliados por eletroforese em gel de poliacrilamida e apresentaram uma banda pr6xima, ou, na mesma altura do padrão de peso molecular, tripsinogênio bovino (24.000 daltons). Os antígenos foram testados frente ao soro de referência positivo e os que apresentaram títulos mais altos e reações nítidas eram em seguida titulados com a solução de IgG. Escolhidas as diluições ideais para o teste de IDGA os antígenos foram testados frente a 120 soros, sendo 60 positivos e 60 negativos. Os resultados obtidos apresentaram uma correlação direta com o antígeno de referência.