Inibição da Na+/K+ATPase pelo derivado esteróide auabaína: Implicações sobre o ciclo de vesículas sinápticas em junção neuromuscular. - Ernani Aloysio Amaral (2006)
Ouabaína é um derivado esteróide cardiotônico e inibidor específico da Na+K+-ATPase. Neste trabalho, os efeitos da ouabaína sobre o ciclo de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de rã foram investigados de forma direta e dinâmica utilizando-se a sonda fluorescente FM1-43. Este marcador consiste em uma molécula anfipática com uma cauda hidrofóbica que promove a ligação da sonda à membrana do terminal axonal. Após um estímulo despolarizante, a membrana marcada com FM1-43 é internalizada por endocitose compensatória de modo que os pools vesiculares podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência sob a forma de pontos fluorescentes. Estimulação adicional na ausência de FM1-43 permite acompanhar e mensurar a exocitose. Assim, a ouabaína foi utilizada para investigação dos efeitos do glicosídeo sobre a captação e liberação de FM1-43 durante o ciclo de vesículas sinápticas. Ouabaína levou a uma redução dose-dependente da fluorescência dos pools vesiculares contendo FM1-43. Este efeito foi dependente da presença de Na+ no meio, mas independente do Ca2+ extracelular. Aplicação simultânea de ouabaína e FM1-43 não resultou em marcação apreciável de terminais motores. Pré-incubação com ouabaína, antes da estimulação elétrica, inibiu a captação de FM1-43, mesmo após lavagem prolongada da preparação. Os resultados obtidos indicam que a ouabaína promove liberação vesicular, mas inibe endocitose. Aplicação de NH4Cl, substância que faz o tamponamento de íons H+, não reverteu os efeitos da ouabaína sobre a captação de FM1-43 sugerindo que a inibição da endocitose não se deve a um efeito de acidificação do terminal pré-sináptico. A exocitose evocada pela ouabaína é dependente dos níveis de sódio no meio, mas independente da presença de cálcio extracelular, sugerindo que a liberação vesicular induzida pela ouabaína seja possivelmente mediada pelo recrutamento de estoques intracelulares de cálcio. Os achados apresentados neste trabalho podem futuramente nortear abordagens celulares e moleculares que esclareçam como as alterações iônicas desencadeadas pela ouabaína interferem com a maquinaria protéica que regula o tráfego de vesículas sinápticas.