Papel dos receptores nicotínicos no relaxamento vascular - Lucas Ferreira Alves (2020)
Os receptores colinérgicos são basicamente de dois tipos: nicotínicos (nAChRs), que formam canais iônicos ativados por ligante e os muscarínicos (mAChRs), que são acoplados à proteína G. Até o momento, é bem aceito que o relaxamento vascular induzido pela acetilcolina (ACh) é mediado pela ativação de mAChRs, presentes no endotélio vascular, principalmente do subtipo M3. Alguns estudos têm demonstrado a presença dos componentes de síntese, transporte e degradação da ACh em vários tecidos não-neuronais. Dados bastante consistentes do nosso grupo, em aorta de camundongos, apontam para um importante papel dos nAChRs α7 na vasodilatação dependente do endotélio mediada pela ACh. No entanto, a existência dos componentes do sistema colinérgico não neuronal em vasos, o mecanismo pelo qual o nAChR participa da resposta vasodilatadora e se esses receptores são funcionais em vasos humanos, ainda não são conhecidos. Portanto, este trabalho propôs estudar a presença do sistema colinérgico não-neuronal em vasos humanos, bem como, avaliar a participação dos nAChRs no relaxamento vascular dependente de endotélio e a sinalização intracelular desencadeada por essa resposta. Foram utilizados segmentos de artéria mamária e veia safena humana de pacientes, de ambos os sexos, submetidos a cirurgias de revascularização cardíaca . Para avaliar a expressão gênica dos componentes do sistema colinérgico foi utilizada a técnica de RT-PCR. A expressão proteica dos receptores mAChR M3 e nAChR α7 foi avaliada por Western blot. Co-imunoprecipitação, seguida de Western blot foi utilizada para avaliar a possibilidade de uma interação física entre os nAChRs e mAChRs. A participação dos nAChRs na resposta vasodilatadora induzida pela ACh foi avaliada utilizando um sistema de banho de órgãos. Para avaliar o mecanismo envolvido na resposta vasodilatadora foi utilizada aorta de camundongo. A determinação da [Ca+2]i foi feita na linhagem de célula endotelial humana EA-hy926 por microscopia de fluorescência. Foi identificado a expressão gênica do transportador de colina de alta eficiência (SLC5A7), das enzimas butirilcolinesterase (BChE) e acetilcolinesterase (AChE), responsáveis pela degradação da ACh, da enzima colina acetil-transferase (CHAT), que realiza a síntese de ACh, além de mAChRs M3 e nAchRs α7. Foi demonstrada também a expressão proteica dos mAChRs M3 e nAChRs α7 no endotélio. Esses dados são consistentes com a presença de um sistema colinérgico não-neuronal (SCNN) em artéria mamária e veia safena de humanos. A ACh induziu um efeito vasodilatador concentração-dependente que foi dependente da presença de um 16 endotélio funcional e abolido pela atropina, um antagonista dos receptores muscarínicos, tanto na artéria mamária como na veia safena de humanos. A estimulação direta dos nAChRs, com um agonista não-seletivo (DMPP) e um agonista seletivo dos nAChRs α7 (PNU-282987), não induziu efeito vasodilatador. Curiosamente, o bloqueio farmacológico com dois antagonistas dos nAChRs mecamilamina e D-tubocurarina, reduziu a resposta vasodilatadora em cerca de 40%. Nossos dados sugerem que o efeito vasodilatador mediado pela estimulação dos mAChRs é, em parte, dependente da ativação dos receptores nAChRs, já que o bloqueio desses receptores diminuiu a resposta vasodilatadora. No entanto, a ativação dos nAChRs é dependente da ativação prévia dos mAChRs. Foi demonstrado a formação de um imunocomplexo ou uma proximidade muito grande entre o mAChRs M3 e o nAChRs α7. Foi possível observar que já na condição basal, esses receptores parecem estar ligados fisicamente no endotélio vascular de aorta de camundongos, e que após estímulo com ACh ou muscarina, na presença e na ausência de atropina, a formação do complexo não é alterada. O mesmo acontece na condição basal em humanos. Esses dados sugerem que o mAChRs M3 e o nAChRs α7 parecem estar ligados fisicamente e/ou muito próximos para co-imuprecipitarem juntos. O bloqueio da pequena proteína G Rho-A com Rhosin (inibidor do domínio de ligação Rho GEF de Rho-A), diminuiu a resposta vasodilatadora induzida pela muscarina na aorta de camundongo. Ainda, o bloqueio farmacológico dos receptores de potencial transitório (TRPs) com bloqueadores não seletivos e seletivos para o subtipo do receptor de potencial transitório vanilóide 4 (TRPV-4), a resposta vasodilatadora foi reduzida em 40%. Esses achados indicam que Rho-A e os TRPs também estar envolvidos na resposta vasodilatadora da ACh. Dessa forma, os dados deste trabalho, em conjunto, mostram que existe um sistema colinérgico não-neuronal na veia safena e na artéria mamária de humanos. Mais importante, estes dados sugerem que os nAChRs α7 participam da resposta vasodilatadora dependente de endotélio mediada pela ACh. O mecanismo parece não envolver uma ativação direta dos nAChR α7, mas sim a ativação do mAChRs M3 que fariam parte de um complexo formado pela heterodimerização com os nAChR α7.