Caracterização fenotípica e funcional dos hemócitos circulantes de Biomphalaria glabrata e Biomphalaria tenagophila, linhagens resistentes e susceptíveis, durante a infecção por Schistosoma mansoni. - Raquel Lopes Martins Souza (2006)
ResumoMoluscos do gênero Biomphalaria, hospedeiros do Schistosoma mansoni possuem um sistema interno de defesa (SID) que compreende células circulantes denominadas hemócitos e fatores solúveis presentes na hemolinfa. Os hemócitos circulantes estão envolvidos na destruição das larvas de tremátodas, porém o mecanismo pelo qual eles destroem o parasito ainda não está totalmente esclarecido. Como em outros gastropodas, os hemócitos circulantes de Biomphalaria não são uma população homogênea e acredita-se que cada tipo celular está envolvido de maneira diferente na destruição do parasito. Um dos objetivos deste trabalho é o de caracterização morfológica do perfil da população dos hemócitos circulantes, através da citometria de fluxo, de caramujos B. tenagophila Taim (resistente ao S. mansoni), B. tenagophila Cabo Frio (parcialmente suscetível ao S. mansoni) e B. glabrata BH (altamente suscetível ao S. mansoni) durante a infecção pelo S. mansoni. Foi possível identificar duas subpopulações de hemócitos, denominadas população de hemócitos pequenos e de hemócitos grandes. Em B. tenagophila não infectado, da linhagem Taim ou Cabo Frio, os hemócitos pequenos representam cerca de 30 % do total de células circulantes, enquanto os hemócitos grandes cerca de 70 %. Entretanto, em B. glabrata os hemócitos pequenos equivalem a 56 % do total, já os grandes são 44 %. Após a infecção pelo S. mansoni, foram observadas variações no perfil da população dos hemócitos circulantes, principalmente nas primeiras horas de infecção, que correspondem a um aumento da porcentagem de hemócitos pequenos. Estas variações foram ausentes em B. glabrata e significativamente marcantes nas linhagens Taim de B. tenagophila. Durante a inoculação de silica nestes caramujos, a análise por citometria de fluxo, demonstrou uma diminuição significativa na porcentagem de hemócitos pequenos e aumento da população de hemócitos grandes. A diminuição da população de hemócitos pequenos poderia ser justificada pelo fato de a sílica destruir pequenos granulócitos que compõem parte da população de hemócitos pequenos. O tratamento com silica também aumentou a granulocidade dos hemócitos, principalmente na linhagem do Taim de B. tenagophila.Elementos solúveis da hemolinfa atuam sinergicamente com os hemócitos na destruição do parasito, dentre eles a lectina tem sido identificadas. As lectinas são encontradas na hemolinfa de moluscos como um fator que aglutina e opsonisa partícula e que pode mediar o reconhecimento de partículas estranhas e/ou parasito. Em moluscos, as lectinas são secretadas pelos hemócitos e podem estar solúveis na hemolinfa ou serem expressas na superfície destas células. Assim, lectinas e/ou lectinas ligantes podem ser importantesmarcadores de ativação de hemócitos em Biomphalaria. Além disso, a ligação lectina-carboidrato pode mediar a adesão de hemócitos de Biomphalaria ao tegumento do esporocisto de S. mansoni, sendo um importante fator na determinação de suscetibilidade à infecção pelo S. mansoni em diferentes linhagens geográficas de B. tenagophila. Na tentativa de verificar esta hipótese, os hemócitos de caramujos B. glabrata (linhagem BH de caramujos altamente susceptível) e B. tenagophila Cabo Frio (linhagem de susceptibilidade moderada) e Taim (linhagem completamente resistente) foram submetidos a marcação com diferentes lectinas conjugados com FITC (ConA, PNA, SBA e WGA) e analisados em microscópio de fluorescência. Os resultados demonstraram que todas as lectinas testadas foram capazes de se ligar superfície dos hemócitos, entretanto, a marcação apresenta diferenças significativas em células isoladas de diferentes espécies de caramujo. B. tenagophila apresentou um maior proporção de hemócitos marcados em relação a B. glabrata. Além disso, a maioria dos hemócitos circulantes de B. tenagophila foi marcada intensamente pelas lectinas PNA e WGA, enquanto os hemócitos de B. glabrata, principalmente por ConA. Durante infecção por S. mansoni, hemócitos marcados por lectinas quase desaparece da hemolinfa do Taim e acumula em B. glabrata BH. Para verificar a relevância funcional das lectinas, hemócitos e hemolinfa de caramujos B. glabrata e B. tenagophila (Cabo Frio e Taim) foram incubados com esporocistos de S. mansoni, axenicamente transformados, na presença ou não de carboidratos N-acetilglicosamina e Galactosamina. Após 6 horas de incubação, foi analisado o índice de adesão celular aos esporocistos e medida a viabilidade do parasito. As análises demonstraram que hemócitos circulantes de B. glabrata não são capazes de produzir encapsulamento dos esporocistos, in vitro, e, conseqüentemente, não ocorre mortalidade expressiva do parasito. Desta forma, a adição de diferentes concentrações de carboidratos também não modificou o padrão de adesão dos hemócitos ou a baixa mortalidade dos esporocitos observada em B. glabrata. Em contraste, o índice de adesão celular de B. tenagophila, Taim e Cabo Frio ao esporocistos, foi maior, resultando em maior mortalidade dos mesmos, especialmente no caso de hemócitos isolados de B. tenagophila Taim. Tanto a adesão quanto a capacidade de destruição dos esporocistos, foram potencializadas na presença da fração solúvel hemolinfa. Hemócitos da linhagem Cabo Frio têm o índice de adesão aumentado pela presença de carboidratos em baixa concentração, enquanto que a linhagem Taim, que apresenta os maiores índices de adesão celular, esta foi amplamente inibida na presença das concentrações mais altas de N-acetilglicosamina e Galactosamina. A inibição da adesão de hemócitos de B. tenagophila Taim ao tegumento do parasito resultou em uma expressiva diminuição da mortalidade dos mesmos. Tais dados sugerem que a resistência da linhagem Taim de B. tenagophila possa estar relacionada quantidade e qualidade das lectinas presentes em sua hemolinfa e/ou à expressão de ligantes (carboidratos) na superfície dos hemócitosDurante a incubação de hemócitos circulantes de Biomphalaria, principalmente quando infectados pelo S. mansoni, estes se revelaram capazes de produzir radicais reativos de nitrogênio. A produção de NO se mostrou dependente do tempo de incubação e do estímulo utilizado. Na presença de esporocistos de S. mansoni transformados in vitro, os hemócitos produziram os maiores valores de NO em comparação aos incubados com antígeno solúvel de ovos (SEA). Entretanto, não foram detectadas diferenças significativas na produção de NO entre as espécies B. glabrata e B. tenagophila.