Busca de genes de Leishmania spp que possam codificar a leishporina e expressão dos produtos gênicos de hemolisinas do tipo III putativas de L.major - Natalia Tomich Paiva Miranda (2010)
A leishporina é uma citolisina formadora de poros descrita pelo nosso grupo, inicialmente em Leishmania amazonensis, mas cuja atividade citolítica foi também detectada em L. major, L. panamensis e L. guyanensis (Noronha,1996; Noronha et al., 1996; Noronha et al., 2000; Almeida-Campos & Horta, 2000). A atividade citolítica da leishporina de L. amazonensis foi detectada em extratos de promastigotas e de amastigotas, mas toda a caracterização desta atividade foi feita em promastigotas. Diversas características desta citolisina e do seu mecanismo de ação já foram determinadas (Noronha et al., 1994; Noronha et al., 1996; Noronha et al., 2000; Almeida-Campos & Horta, 2000 Castro-Gomes et al., 2009). O fato de parasitas do gênero Leishmania, causador de diversas formas de leishmaniose, possuírem uma proteína formadora de poros gera a questão óbvia de que função tal proteína poderia ter. É esta a pergunta que queremos responder. A resposta, no entanto, depende de conhecermos a identidade molecular da leishporina. Dentre as abordagens que estão sendo utilizadas em nosso laboratório para a identificação desta citolisina estão: 1) purificação da proteína a partir de extratos do parasita, 2) produção de um banco de dados com proteínas formadoras de poros (PFPs) funcionalmente caracterizadas para verificar o grau de homologia com genes de L. major, 3) screening funcional de bibliotecas de cDNA e 4) caracterização dos genes de L. major anotados como hemolisinas no banco de dados GeneDB. As duas últimas abordagens foram o alvo do presente trabalho. Com o screening funcional de uma biblioteca de cDNAs da forma amastigota de L. amazonensis, construída em fago T7, não foi possível identificar proteínas hemolíticas, uma vez que a biblioteca havia perdido a sua representatividade. Esta é uma abordagem que utilizaremos novamente, tentando amplificar esta biblioteca de forma representativa, além de realizar um novo screening com uma biblioteca cDNA da forma promastigota de L. amazonensis construída em nosso laboratório. Quanto à segunda abordagem, encontramos 4 sequências anotadas como hemolisinas do tipo III no banco de dados GeneDB de L. major. Demonstramos existência de RNAs mensageiros para estes quatro genes e determinamos o nível de expressão relativa de cada um deles na forma promastigota do parasita. Experimentos de clonagem e expressão em bactéria nos indicaram que esses genes possam ser tóxicos para a bactéria E. coli e, portanto, um outro sistema será utilizado para a expressão destas proteínas.