Padronização e aplicação da técnica de PCR "nested" no diagnóstico do circovirus suíno tipo II em tecidos - Flavia Ferreira Pinto (2004)
Circovirus suíno tipo 2 (CVS-2) são agentes patogênicos recentemente associados à síndrome da refugagem pós-desmame (SRPD), uma doença emergente de distribuição mundial. Foi padronizada uma nested PCR para a detecção do CVS-2 em amostras de tecidos congelados, parafinados e formolizados, baseada na amplificação de segmentos contidos na ORF-2 do CVS-2. A especificidade da PCR foi avaliada pela análise do perfil do tamanho de fragmentos restringidos com a enzima EcoRI do produto de 225 pares de bases da amostra de campo 1D e da amostra controle positiva N682/99 da Espanha, e, pela análise da seqüência de nucleotídeos desses mesmos fragmentos. Utilizando diluições seriadas de cópias de plamídio contendo o inserto de 481 e 225 pares de bases, a sensibilidade obtida foi de 97 pg ou 29,38 X 106 e 6 pg ou 1,8 X 106 cópis de DNA viral para a reação externa e nested respectivamente,. Em sobrenadante de cultivo celular infectado com uma amostra de CVS-2, a PCR foi capaz de detectar o DNA do CVS-2 até a diluição 10-4 para a reação externa e até 10-8 para a reação nested partindo de uma suspensão viral com título 10-3 TCID50/50µl. A sensibilidade da PCR para detecção do DNA em tecidos congelados, parafinados e formolizados foi comparada e o limite de detecção da reação nested em tecidos congelados foi de 500 ng, para tecidos parafinado 300 ng e para tecidos formolizados 100 ng de DNA. Amostras clínicas foram obtidas de 19 animais provenientes de oito granjas localizadas nos municípios de Patrocínio, Oliveira, Pará de Minas, Ponte Nova, Igarapé, Viçosa e Pompeu pertencentes ao estado de Minas Gerais, sete animais provenientes de duas granjas localizadas nos municípios de Entre Rios do Oeste e Medianeira, no estado do Paraná e seis animais de uma granja localizada no município de Rio Verde, no estado de Goiás. Os animais apresentam idade entre 26 e 120 dias e natimortos. Amostras de três animais, com idade aproximada de 150 dias, coletadas no momento do abate, em um frigorífico foram incluídas neste estudo. Foram avaliadas, um total de 35 amostras clínicas de tecidos congelados, 32 parafinados e 23 amostras formolizadas. A reação nested detectou o CVS-2 em 34 (97,1%) amostras de tecidos congelados, 28 (87,5%) amostras parafinadas e 20 (87%) amostras formolizadas, comprovando uma alta prevalência do vírus nos rebanhos analisados. Somente a amostra proveniente de uma granja localizada no município de Pompeu, foi negativa. Em 12 amostras analisadas, a nested PCR foi comparada às técnicas de hibridização in situ, imunohistoquímica e análise histopatológica. Todas amostras foram positivas na PCR, duas amostras com lesões sugestivas da SRPD na análise histológica embora as 12 amostras tenham apresentado resultados negativos quando se utilizou a técnica de hibridização in situ e imunohistoquímica. A PCR desenvolvida apresentou-se como uma ferramenta sensível, específica e rápida para a detecção do ácido nucléico do CVS-2 em amostras clínicas.