Genomic identification, gene expression and enzyme activity of CAZymes from biotrophic fungus Hemileia vastatrix during coffee leaf infection - Júlia Santos Pereira (2021)
A ferrugem, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma das principais doenças do cafeeiro e gera grandes prejuízos econômicos. O H. vastatrix, por ser um fungo biotrófico, tem seu crescimento e reprodução totalmente dependentes das células do hospedeiro vivo. Sendo assim, infecta o tecido pelos estômatos, sem causar necrose. Apesar disso, sabe-se que alguns fungos durante a interação com a planta podem expressar genes envolvidos na formação de estruturas infecciosas, bem como sintetizar enzimas que auxiliam na penetração pela parede celular do hospedeiro. Pouco ainda se sabe sobre a importância das enzimas que degradam parede celular durante a infecção por fitopatógenos biotróficos. Aqui, realizamos uma análise genômica com o objetivo de identificar CAZymes (em inglês, Carbohydrate Active EnZymes) produzidas por H. vastatrix, além da análise da expressão gênica e atividade enzimática durante a infecção do cafeeiro. A primeira etapa foi a predição ab initio do genoma de H. vastatrix, utilizando o programa AUGUSTUS ajustado com dados de RNA-seq do próprio fungo para definição do modelo. A anotação funcional para identificar CAZymes foi realizada utilizando o programa dbCAN2. Dentre as 345 CAZymes encontradas, 162 pertencem às Glicosídeo Hidrolases (GH), incluindo 34 endoglucanases, xilanases e poligalacturonases das famílias GH 5, 9, 10, 12 e 28 - que podem atuar durante infecção fúngica degradando componentes da parede celular, representados por celulose, xilana e pectina, respectivamente. Parâmetros físico-químicos dessas enzimas foram preditos, incluindo identificação de resíduos catalíticos e domínios padrões de CAZymes na sequência primária e estrutura modelada. Além disso, análises de expressão das enzimas foram realizadas utilizando dados de RNA-seq de um genótipo de C. arabica suscetível à infecção, portanto apresentando interação compatível com o patógeno, nos tempos 0, 12, 24 e 96 horas após a inoculação (hai) com o fungo. Ensaios de atividade enzimática foram realizados para verificar se essas enzimas também atuam durante a infecção fúngica. As enzimas apresentaram características físico-químicas e estruturais típicas de enzimas ativas, incluindo a conservação dos sítios catalíticos. Genes que codificam endoglucanases e xilanases são expressos em diferentes momentos da infecção por H. vastatrix, sendo o primeiro mais expresso em 12 hai e o segundo em 24 hai. Em concordância com os dados de expressão, as endoglucanases começam a ser produzidas precocemente e são mais ativas a 24 hai, enquanto as xilanases têm maior atividade a 96 hai. Esses resultados sugerem que fungos biotróficos também utilizam enzimas ativas sob carboidratos durante a infecção. No caso de H. vastatrix, essas enzimas começam a ser produzidas na fase pré-haustorial da infecção do fungo, mas são mais ativas na fase pós-haustorial, quando o haustório já começa a ser formado nas membranas do hospedeiro e na parede celular da planta.