Caracterização de cepas de Entamoeba histolytica isoladas de diferentes casos clínicos no brasil: análise da expressão de genes possivelmente envolvidos com a patogenicidade - Michelle Aparecida Ribeiro de Freitas (2007)
ResumoA amebíase é uma infecção humana causada pela Entamoeba histolytica, um parasita patogênico e invasivo que causa morte de cerca de 100.000 indivíduos por ano, causando principalmente, uma colite fulminante. Um dos aspectos mais interessantes na biologia amebiana é a grande variabilidade no potencial virulento das mesmas. A E. histolytica tem uma notável habilidade de destruir tecidos, apresentando assim um comportamento patogênico. Como esse comportamento não se estende por todas as cepas, as bases moleculares do processo de citotoxicidade têm sido muito investigadas. Dados da literatura sugerem que as Cisteil proteinases (CP) tem uma importante contribuição na invasão e destruição de tecidos pela E. histolytica. Este trabalho tem como objetivo a caracterização da virulência em cepas de E. histolytica isoladas de diferentes casos clínicos e análise da expressão diferencial de genes possivelmente envolvidos com a virulência, utilizando as técnicas de supressão por hibridização subtrativa (SSH) e microarray. Para isto, as cepas foram mantidas em cultura axênica e caracterizadas quanto a capacidade de produzir lesão em fígado de hamster, efeito citopático em células CHO e atividade de CP. A expressão dos genes que codificam a CP das cepas foi analisada através da técnica de microarray, utilizando a cepa HM1 como controle, para esse estudo foram selecionadas duas cepas de E. histolytica isoladas de pacientes assintomáticos (452 e 32) e três cepas isoladas de pacientes sintomáticos (EGG, HM1 e DRP). Os resultados do microarray foram confirmados pela técnica de PCR em tempo real. Para a análise da diferença de expressão pela técnica de SSH foram utilizadas a cepa mais virulenta, EGG e a menos virulenta, 452. Esta metodologia combina o hibridização de cDNA com a técnica de PCR e permite a seleção de genes com expressão diferenciada nas amostras analisadas. Nossos resultados demonstraram que a caracterização das cepas, tanto, in vivo quanto in vitro, concordavam com os sintomas clínicos dos pacientes de onde as cepas foram obtidas. Foi observada uma grande variação na virulência entre as cinco cepas analisadas, no entanto, nossos resultados demonstraram diferença estatística na expressão apenas no gene CP1, para as cepas EGG e HM1.Em nossos resultados de subtração identificamos 9 fragmentos de cDNAs, os quais apresentaram alta homologia a genes já previamente seqüenciados do genoma de E. histolytica. Mas apenas quatro destes genes foram confirmados pela RT- PCR. Dentre eles estão duas proteínas hipotéticas e uma proteína rica em cisteína, sendo expressos na cepa EGG e a proteína Grainin 2 expressa na cepa 452. Os resultados do microarray sugerem que as funções de avaliação da virulência realizadas neste estudo têm pouca relação com a expressão de cisteil proteinase. A técnica de SSH foi uma boa ferramenta para identificação rápida de novos genes diferencialmente expressos e a análise desses genes pode expandir a compreensão sobre a patogênese amebiana, identificando genes que podem constituir alternativas como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos e novas técnicas de diagnóstico.