Avaliação do papel da via FAK/SRC na proliferação e apoptose em linhagem celular JAK2V617F positiva - Valente, Ana Carolina Menezes Mendonça (2022)
As Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas (NMPC) configuram-se como um grupo de doenças clonais da célula-tronco hematopoética que resultam em acúmulo das células mieloide. Dentre elas incluem-se a Policitemia vera (PV), a Trombocitemia essencial (TE) e a Mielofibrose Primária (MF). A identificação da mutação adquirida JAK2V617F em pacientes com PV, TE e MF permitiu o melhor entendimento da patogênese dessas doenças, visto que a ativação constitutiva da tirosina quinase JAK2 tem papel importante no aumento da proliferação celular e resistência à apoptose. No entanto, ainda não existe um tratamento farmacológico que leve todos os pacientes à remissão molecular, justificando o estudo de novos alvos moleculares. Por sua vez, a proteína Quinase de Adesão Focal (FAK), possui importante influência nos processos de proliferação, migração, sobrevivência celular e apoptose e, por estar superexpressa em diversas neoplasias, configura-se um alvo promissor no desenvolvimento de fármacos contra o câncer. O presente estudo propõe avaliar o papel da proteína FAK na proliferação e apoptose da linhagem celular SET-2, positiva para a mutação JAK2V617F. Assim, foram analisados: (1) interação entre FAK e SRC por imunoprecipitação; (2) o efeito do inibidor da FAK (PF 562,271) na viabilidade e proliferação celular por MTT; (3) efeito do inibidor da FAK na indução da apoptose avaliando-se a expressão de PARP clivado e Caspase 3 Clivada por Western Blotting; (4) efeito do inibidor da JAK (ruxolitinibe) na expressão de p-SRC e SRC. Além disso, um banco de dados de RNAseq da linhagem SET-2 tratada com INC424 (ruxolitinibe) por 4h e 48h (GSE 69827), disponível no banco de dados público "Gene Expression Omnibus" foi analisado. A expressão gênica diferencial e a correlação entre a expressão do gene PTK2 e outros 65 genes envolvidos em proliferação, sobrevivência, apoptose e adesão foi feita utilizando-se o software R studio. Os resultados indicam que o inibidor da FAK PF 562,271 reduziu significativamente a viabilidade celular e a proliferação das células SET-2 a partir da concentração de 5 µM, sendo 71,5%, 85,5%, 83,7% e 86,3% a redução da viabilidade para os tratamentos com 5 µM,10µM, 25 µM e 50 µM, respectivamente. O inibidor também induziu apoptose, pois houve aumento na expressão de PARP clivada e Caspase 3 clivada após tratamento. As análises do banco de dados de RNAseq demonstraram que o inibidor da JAK modulou a expressão do gene PTK2 e de outros genes envolvidos nos processos de proliferação, apoptose e adesão celular. Com relação aos genes relacionados com adesão celular, os genes PTK2, SRC, PXN, TLN1, DCC, ITPKC e FLNA apresentaram aumento da expressão e CRK, PTRH2, VCL, CASS4, ACTB, ZYX, VASP, CTNNB1 e BCAR1 apresentaram expressão diminuída. Com isso, os resultados do presente trabalho apontam que a inibição da FAK sensibiliza a linhagem celular SET-2 a sofrer apoptose, reduzindo assim a viabilidade e o tratamento com o inibidor da JAK INC424 influencia na expressão do gene PTK2 e de outros genes relacionados com a via de adesão focal.