Análise física e bioquímica de vesículas extracelulares isoladas com depleção de lipoproteínas plasmáticas - Merij, Laura Botelho (2022)
Vesículas extracelulares (EVs) são pequenas vesículas membranosas liberadas por todos os tipos de células. As EVs são capazes de transportar diversas biomoléculas provenientes da célula parental e transferi-las para as células-alvo de forma objetiva. Assim, as EVs podem participar de vários processos biológicos mediando a comunicação celular, a resposta imune e a homeostase. Tentativas anteriores de isolar EVs do plasma mostraram contaminação por lipoproteínas, o que é um complicador nos estudos de EVs, uma vez que as lipoproteínas também podem modular respostas metabólicas e inflamatórias. Dessa forma, nosso objetivo foi padronizar protocolos para isolamento de EVs evitando contaminação por lipoproteínas. No primeiro trabalho abordado nessa dissertação apresentamos um protocolo padronizado por nosso grupo para a separação concomitante de EVs e lipoproteínas de baixa ou muito baixa densidade (LDLs ou VLDLs) do plasma através da ultracentrifugação de um gradiente de densidade (G-UC). No trabalho seguinte, avaliamos diferentes métodos para isolamento de EVs sem contaminação por lipoproteínas após a depleção das lipoproteínas por G-UC. Primeiramente, o plasma foi aplicado a G-UC para a depleção de lipoproteínas e foi então submetido a centrifugação seriada (SC) ou a uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para isolamento das EVs. A análise e identificação da população de EVs foi feita por meio da análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e citometria de fluxo. A ausência de lipoproteínas nas populações de EVs isoladas foi confirmada através da quantificação de colesterol e detecção da apolipoproteína B100 (apoB-100) por western blot. Complementarmente, realizamos análiseproteômica visando a investigação em larga escala de proteínas das EVs isoladas através das diferentes abordagens. Nossos resultados demonstraram que a SEC separa EVs de lipoproteínas de alta densidade (HDL), mas não de LDLs ou VLDLs, que permaneceram contaminantes. O G-UC, por sua vez, foi eficiente na separação de lipoproteínas da fração plasmática, permitindo o isolamento subsequente de EVs depletadas da contaminação por lipoproteínas. Análise proteômica, quantificação de colesterol e detecção de apo B-100 confirmaram a eliminação da contaminação por LDL e VLDL das EVs isoladas através da SEC após G-UC. Além disso, aanálise proteômica identificou números de proteínas e vias biológicas semelhantes em EVs isoladas, independentemente da depleção de lipoproteínas, o que foi consistente com as fontes celulares semelhantes identificadas por citometria de fluxo. Conjuntamente, nossos resultados demonstram que a combinação de G-UC seguida de SEC pode fornecer EVs livres de lipoproteínas sem viés de origem e função celular, permitindo a obtenção de EVs de alta pureza com potenciais implicações para ensaios funcionais e análises lipidômicas.