Avaliação da toxicidade de nanomateriais em diferentes modelos biológicos e aplicações na transfecção gênica - Pereira, Michele Munk (2013)
Os nanotubos de carbono multicamadas (MWCNT) e as nanofibras de celulose (NFCs) são interessantes nanomateriais (NMs) que possuem grande potencial de aplicação em áreas como tratamento de água, reforço de materiais, engenharia tecidual e entrega de moléculas terapêuticas. Em especial, os MWCNT são promissores vetores de DNA em células e embriões de mamíferos. Porém, o desenvolvimento desta área está relacionado à padronização de sistemas para avaliar o potencial impacto dos NMs na saúde humana e ambiental. O objetivo geral deste estudo foi avaliar a toxicidade de MWCNT e NFC em diferentes modelos biológicos (fibroblastos e embriões bovinos; microalgas) e o potencial de carreamento gênico de MWCNT-COOH em fibroblastos e embriões bovinos. No experimento 1, foi avaliada a viabilidade e a morfologia dos fibroblastos cultivados in vitro expostos às NFCs e aos MWCNT-COOHs. Os resultados deste experimento revelaram que em baixas concentrações (0,02-100μg ml-1) as NFC não foram citotóxicas (P = 0,06). Porém, concentrações acima de 200 μg ml-1 NFC diminuíram a viabilidade celular e causaram mudanças na morfologia das células. Para os MWCNT-COOH, a exposição dos fibroblastos a 100μg ml-1 reduziram a viabilidade (P= 0,001) e alteram a morfologia celular. No experimento 2, foram analisados os efeitos desses NMs no desenvolvimento, expressão gênica e apoptose in situ de embriões bovinos produzidos in vitro. Neste ensaio, os NMs não influenciaram o desenvolvimento (P=0,24) e o índice de apoptose embrionária (P=0,82). Contudo, os MWCNT-COOH alteraram a expressão de genes (P=0,02) relacionados à totipotência, diferenciação e estresse celular de forma mais acentuada quando comparada às NFCs. No experimento 3, o potencial ecotóxico das NFCs e dos MWCNTs foi estudado em microalgas Chlorella vulgaris e Klebsormidium flaccidum mediante análise de Potencial Zeta, viabilidade celular, atividade fotossintética e de enzimas antioxidativas, quantificação dos níveis de ATP e microscopia eletrônica. Os resultados revelaram que os MWCNTs e as NFCs afetaram a viabilidade (P<0,001), a fotossíntese (P<0,05), a atividade de enzimas antioxidativas (P<0,05), os níveis de ATP (P<0,05) e a morfologia celular das microalgas em concentrações, tempos e sistemas de cultura específicos. No experimento 4, os fibroblastos e embriões bovinos foram transfectados com MWCNT-COOH complexados ao plasmídeo contendo o gene que codifica a proteína verde fluorescente (pGFP). As análises de microscopia de fluorescência detectaram que o gene GFP foi expresso nas células e nos embriões no estágio inicial de desenvolvimento (2 a 8 células). Entretanto, a expressão de GFP não foi observada no estágio de blastocisto. A análise por PCR confirmou a presença do gene GFP nos fibroblastos (3,30% GFP+) e embriões de 2-8–células (46,67% GFP+). Em conclusão, nas condições testadas, a exposição de fibroblastos a baixas concentrações de MWCNT-COOH ou NFC não causaram impacto na viabilidade e morfologia celular. Entretanto, os MWCNTs e as NFCs foram citotóxicas para as microalgas estudadas. O uso de MWCNT-COOH como vetor de DNA em embriões bovinos mostrou-se promissora, o que abre possibilidades de geração de animais transgênicos por este método.