Padronização de PCR para detecção direta e diferenciação de espécies de Campylobacter em Queijo Minas Artesanal - Gonçalves, Amanda Gonelli (2018)
O Queijo Minas Artesanal (QMA) é um dos mais antigos e tradicionais queijos do Brasil e contribui para a geração de renda de diversos produtores rurais. Sua produção é caracterizada pela utilização de leite cru recém-ordenhado. Embora muito popular, o QMA nem sempre apresenta inocuidade suficiente, tornando-se necessário intensificar a demanda por estudos mais representativos sobre a segurança microbiológica deste produto. Campylobacter spp. tem sido o patógeno mais frequentemente associado a surtos de doenças de origem alimentar em todo o mundo nos últimos anos, entretanto, é um patógeno negligenciado em estudos de prevalência e nos critérios microbiológicos na legislação para queijos no Brasil. A detecção de Campylobacter spp. por métodos clássicos de identificação é de difícil execução e pode apresentar significativas variações nos resultados obtidos. Os métodos moleculares, em especial a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são ferramentas promissoras para a rápida e direta detecção de Campylobacter spp. em alimentos, devido sua alta especificidade, sensibilidade e bom limite de detecção. O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia molecular baseada em PCR multiplex para identificação direta de Campylobacter spp. e diferenciação das espécies Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em QMA do Serro. A PCR multiplex foi desenvolvida utilizando iniciadores 16S rRNA, hipO e ceuE, específicos para a detecção de Campylobacter spp., C. jejuni e C. coli, respectivamente. Para a padronização da metodologia foram testadas 5 combinações variando-se as concentrações de MgCl2 (1,0μ L/2,0μ L), tampão (2,5μ L/3,5μ L), DNA (10μ L/5μ L), agarose (1,0%/1,5%), além de modificações na voltagem (120V/80V) e temperatura de anelamento (66°C/62°C). A partir da padronização, realizou-se avaliação do limite de detecção (LD), utilizando as concentrações de 0,1, 10, 103 e 105 UFC/g. Testes com enzimas de restrição XhoI, HhaI e HindIII foram realizados para gerar evidência adicional sobre a seletividade do método. Também foi avaliada a presença de Campylobacter spp. em amostras de campo. A PCR multiplex padronizada mostrou ser um método rápido e efetivo na detecção de Campylobacter spp., C. jejuni e C. coli em amostras de QMA artificialmente contaminadas. O LD foi estimado em 103 UFC/mL. Os testes com as enzimas de restrição confirmaram a seletividades dos primers. Ao avaliar a presença deste patógeno em amostras de campo, houve inconsistência nos resultados utilizando a PCR multiplex. O método mostrou-se efetivo para a detecção de Campylobacter spp. no queijo artificialmente contaminado e inconsistente para a pesquisa deste patógeno em amostras de campo, o que pode ser explicado pelo LD. Como perspectiva futura, foi proposto implementar a etapa de enriquecimento seletivo das amostras para elevar a sensibilidade do método, bem como validação da metodologia para avaliar a especificidade da PCR.